Тема 8. Обмен сложных белков

Лабораторная работа № 15.

Определение концентрации мочевой кислоты в биологических жидкостях ферментативным методом

 

 

Принцип метода: Мочевая кислота под действием фермента уриказы окисляется до алантоина с образованием перекиси водорода. Пероксид водорода реагирует с хромогеном (4-аминоантипирин с N-этил-N-(гидрокси-3-сульфопропил)-m-толуидином [TOOS]) с образованием сине-фиолетового красителя:

 

Уриказа Мочевая кислота + Н2О + О2 ----------------> Алантоин + СО2 = Н2О2

Пероксидаза 2Н2О2 + ТООS + 4-Амноантипирин ------------------------> Индамин + 3Н2О

 

Интенсивность окраски раствора при длине волны 550 нм прямо пропорциональна концентрации мочевой кислоты в нем.

 

Линейность метода: 65,7 -1190 мкмоль/л.

Норма:

Сыворотка крови – мужчины – 214-488 мкмоль/л (25-37°С);

женщины – 137-363 мкмоль/л (25-37°С).

 

Концентрация мочевой кислоты сохраняется стабильной в сыворотке/ плазме в течение 3 дней при комнатной температуре, при температуре хранения 2-8°С – в течение 7 дней, при температуре –20°С – в течение 6 месяцев.

Стабильность концентрации мочевой кислоты в моче – 4 дня при комнатной температуре.

 

Оборудование и реагенты:

1) Спектрофотометр с термостатированной кюветой, длина волны 550 нм, длина оптического пути 1 см; температура реакции 25-37°С;

2) Секундомер;

3) Автоматические пипетки на 20 мкл, 250 мкл и 1000 мкл;

4) Сыворотка крови/ гепаринизированная или ЭДТА- плазма / моча. Мочу предварительно развести дистиллированной водой в соотношении 1:10;

5) Реагент 1 (ТООS 1 ммоль/л в фосфатном буфере, рН 7,0 100 ммоль/л);

6) Реагент 2 (уриказа ³ 50 Е/л, пероксидаза ³ 1000 Е/л, 4-аминоантипирин 0,3 ммоль/л в фосфатном буфере, рН 7,0 100 ммоль/л);

7) Стандарт (раствор мочевой кислоты 357 мкмоль/л);

8) Дистиллированная вода.

 

Проведение анализа

Добавить в кювету	Опытная проба	Холостая проба	Стандартная проба
1. Образец (например, сыворотка)	20 мкл	--	--
2. Стандарт	--	--	20 мкл
3. Дистиллиро-ванная вода	--	20 мкл	--
4. Реагент 1.	1 мл	1 мл	1 мл
Перемешать содержимое пробирок, инкубировать 5 мин
5. Реагент 2	250 мкл	250 мкл	250 мкл

 

Перемешать содержимое каждой пробирки. Инкубировать 10 мин при комнатной температуре или 5 мин при температуре 37°С. Измерить оптическую плотность опытной и стандартной проб против холостой пробы при длине волны 550 нм (оптическая плотность DА). Окраска стабильна в течение 30 минут.

 

Расчет

Расчет по стандарту концентрации мочевой кислоты в биологической жидкости проводят по формуле:

DАоп С (мкмоль/л) = ----------- ´ Сст, DАст

где DА_{оп / ст} – оптическая плотность опытной и стандартной проб, соответственно;

С_ст – концентрация стандарта (мкмоль/л).

Расчет по стандарту концентрации мочевой кислоты в моче проводят по формуле:

DАоп С (ммоль/л) = ----------- ´ Сст ´ 11, DАст

где DА_{оп / ст} – оптическая плотность опытной и стандартной проб, соответственно;

С_ст – концентрация стандарта (мкмоль/л);

11 – коэффициент разведения.

Если концентрация мочевой кислоты превышает 1190 мкмоль/л (точка вне зоны линейности калибровочного графика), анализируемый образец (сыворотка или моча) следует развести 1:1 физиологическим раствором и повторить измерение, а полученный результат расчета умножить на 2.

Клинико-диагностическое значение: Мочевая кислота и ее соли являются конечными продуктами пуринового обмена.

При подагре, наиболее общем осложнении гиперурикемии, повышенный уровень мочевой кислоты в сыворотке крови ведет к образованию вокруг суставов кристаллов моноуреата натрия. Гиперурикемия наблюдается также при заболеваниях почек с пониженной экскрецией отходов жизнедеятельности, при голодании, употреблении наркотиков, избыточном потреблении алкоголя, а также при приеме некоторых лекарств. Гиперурикемия – составная часть непрямого фактора риска коронарной болезни сердца.

Гипоурикемия наблюдается редко и связана с редкими наследственными нарушениями метаболизма.

 

Лабораторная работа № 16.