Определение общей активности креатинкиназы в сыворотке крови кинетическим методом

 

Принцип метода: Креатинкиназа (КК) катализирует обратимое фосфорилирование АДФ в присутствии креатинфосфата с образованием АТФ и креатина. Фермент гексокиназа (ГК) катализирует фосфорилирование глюкозы АТФ с образованием АДФ и глюкозо-6-фосфата. Затем глюкозо-6-фосфат под действием глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы (Г6ФДГ) окисляется до 6-фосфоглюконата с одновременным восстановлением НАД⁺ до НАДН.

 

КК АДФ + Креатинфосфат -----------> Креатин + АТФ

ГК АТФ + Глюкоза -----------> АДФ + Глюкозо-6-фосфат

Г6ФДГ Глюкозо-6-фосфат + НАД^+ -----------> 6-фосфоглюконат + НАДН + Н^+

 

Кинетическое спектрофотометрическое определение активности КК основано на регистрации возрастания оптической плотности анализируемой пробы при длине волны 340 нм. Скорость увеличения оптической плотности пробы при длине волны 340 нм прямо пропорциональна активности КК в ней.

 

Линейность метода: до 1500 Е/л.

Норма: мужчины – 0-160 Е/л (37°С);

женщины – 0-130 Е/л (37°С).

У новорожденных уровень КК в 2-3 раза превышает уровень взрослых.

КК в сыворотке сохраняет стабильность при комнатной температуре (18-25°С) в течение 48 часов, при температуре хранения 2-8°С в течение 1 недели и при замораживании (-20°С) в течение 1 месяца в плотно закупоренном флаконе.

Оборудование и реагенты:

1) Спектрофотометр с термостатированной кюветой, длина волны 340 нм, длина оптического пути 1 см; температура реакции 37°С;

2) Секундомер;

3) Автоматические пипетки на 25 мкл и 1000 мкл;

4) Сыворотка крови;

5) Дистиллированная вода;

6) Рабочий реагент (креатинфосфат – 30 ммоль/л, АДФ – 2,0 ммоль/л, D-глюкоза – 20 ммоль/л, НАД+ - 2,0 ммоль/л, ГК - > 2500 Е/л, Г6ФДГ - > 2000 Е/л, буфер (рН 6,7±0,1) – 100 ммоль/л).

Рабочий реагент годен для применения, если его оптическая плотность не выше 0,7 единиц оптической плотности при длине волны 340 нм.

Проведение анализа

Перед проведением анализа реагенты следует прогреть до температуры измерения (37°С).

Добавить в кювету	Опытная проба
1. Сыворотка	25 мкл
2. Рабочий реагент	1 мл

 

Перемешать содержимое пробирки и включить секундомер. Измерить оптическую плотность пробы против дистиллированной воды при длине 340 нм ровно через 2 мин. Повторить измерение 2 раза с интервалом 1 мин. Рассчитать изменение оптической плотности за каждую минуту а затем вычислить среднее измерение оптической плотности в минуту (Dо.п./мин).

 

Расчет

Расчет по фактору активности КК проводят по формуле:

 

Dо.п./мин ´ 1,025 ´ 1000 АКК (Е/л) = ----------------------------------- = Dо.п./мин ´ 6592, 6,22 ´ 0,025 ´ 1,0

 

где Dо.п./мин – среднее изменение опт.плотн. в минуту;

1,025 – общий объем раствора в кювете;

1000 – коэффициент перевода мл в л;

6,22 – коэффициент миллимолярного поглощения НАДН;

0,025 – объем сыворотки в мл;

1,0 – длина оптического пути.

 

При внесении каких-либо изменений в перечисленные параметры фактор следует пересчитать. Если активность КК превышает 1500 Е/л (точка вне зоны линейности калибровочного графика), анализируемую сыворотку следует развести 1:1 физиологическим раствором и повторить измерение, а полученный результат расчета умножить на 2.

 

Клинико-диагностическое значение: Повышение активности КК в сыворотке крови может быть следствием повреждения сердечной или скелетной мускулатуры.

При поражении сердечной мышцы (инфаркт миокарда, миокардит, сердечные аритмии, сердечная недостаточность) активность КК может вырасти в 20-30 раз по сравнению с нормой.

При поражении скелетной мускулатуры уровень активности КК возрастает еще больше.

При инфаркте миокарда, как правило, подъем активности КК наступает через 4-8 часов после начала болевого приступа, достигает максимума через 16-36 часов, и нормализуется к 3-6 дню. МВ-фракция КК является высокоспецифичной для сердечной мышцы, ее активность, как правило, значительно повышается при инфаркте миокарда.

Повышение активности КК может быть вызвано и другими причинами, например: употреблением алкоголя, отравлением снотворным, внутривенным введением ряда лекарственных препаратов.

 

 

 

ТЕМА 3. БИОСИНТЕЗ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И БЕЛКОВ (МАТРИЧНЫЕ БИОСИНТЕЗЫ)

Лабораторная работа № 4.