Тема 1. Строение и функции белков

ТЕМА 1. СТРОЕНИЕ И ФУНКЦИИ БЕЛКОВ

Лабораторная работа № 1.

Количественное определение общего белка в сыворотке крови биуретовым методом

 

 

Принцип метода: Ионы меди в щелочной среде реагируют с белком с образованием комплекса фиолетового цвета. Оптическая плотность образующегося комплекса прямо пропорциональна содержанию белка в пробе.

 

Линейность метода: 10 – 150 г/л.

Норма: 62 – 85 г/л.

Общий белок в негемолизированной сыворотке сохраняет стабильность при комнатной температуре (18-25°С) в течение 7 дней, при температуре хранения 2-8°С в течение 1 месяца в плотно закупоренном флаконе.

 

Оборудование и реагенты:

1) Спектрофотометр с термостатированной кюветой, длина волны 540 нм, длина оптического пути 1 см; температура реакции 18-25°С;

2) Секундомер;

3) Автоматические пипетки на 20 мкл и 1000 мкл;

4) Сыворотка крови;

5) Физиологический раствор;

6) Реагент (гидроксид натрия – 600 ммоль/л, калий-натрий тартрат – 32 ммоль/л, сульфат меди – 12 ммоль/л, иодид калия – 30 ммоль/л);

7) Калибратор – калибровочный раствор общего белка, 80,0 г/л.

 

Проведение анализа

Добавить в пробу:	Холостая проба	Калибровочная проба	Опытная проба
1. Калибратор	--	20 мкл	--
2. Сыворотка	--	--	20 мкл
3. Реагент	1 мл	1 мл	1 мл

 

Перемешать тщательно содержимое пробирок и инкубировать при температуре 25°С в течение 10 минут. Измерить оптическую плотность опытной (А_оп) и калибровочной (А_калиб) проб против холостой пробы при длине волны 540 нм.

Окраска раствора стабильна в течение 30 минут.

Гемолиз и липемия влияют на результат, поэтому для таких проб анализ следует выполнять с бланком по пробе (20 мкл сыворотки смешивается с 1 мл физраствора). Измеряется оптическая плотность бланка против физраствора и ее значение вычитается из оптической плотности анализируемой пробы.

 

Расчет

Содержание общего белка в сыворотке рассчитывают по стандарту (калибратор) по формуле:

 

Аоп С(г/л) = ------------ ´ Скалиб, Акалиб

где С – концентрация общего белка в анализируемой пробе, г/л;

А_оп – оптическая плотность опытной пробы;

А_калиб – оптическая плотность калибровочной пробы;

С_калиб – концентрация общего белка в калибраторе.

 

При содержании общего белка в пробе свыше 150 г/л (точка вне зоны линейности калибровочного графика), анализируемую сыворотку следует развести 1:1 физиологическим раствором и повторить измерение, а полученный результат расчета умножить на 2.

 

Клинико-диагностическое значение: Изменения содержания общего белка в сыворотке крови происходят по причине:

1) снижения интенсивности биосинтеза белка в тканях;

2) усиленного распада тканевых белков;

3) нарушения водного баланса;

4) потери белка почками, с кровью.

Гипопротеинемия наблюдается при нефротическом синдроме, синдроме мальабсорбции, заболеваниях кожи (ожог, экзема), массивных кровотечениях, задержке солей и воды (заболевания почек), неправильном питании и голодании. Нарушением синтеза белка, приводящему к снижению его концентрации в сыворотке крови, сопровождаются раковая кахексия, длительные воспалительные процессы.

Гиперпротеинемия наблюдается при состояниях и болезнях, сопровождающихся дегидратацией организма (тяжелые травмы, понос, рвота, сахарный диабет). Она характерна также для хронических воспалительных заболеваний (ревматоидный артрит, диффузные болезни соединительной ткани – коллагенозы, цирроз печени) и острых воспалительных процессов в стадии острой фазы, наблюдается также при макроглобулинемии Вальденстрема.

 

ТЕМА 1. СТРОЕНИЕ И ФУНКЦИИ БЕЛКОВ

Лабораторная работа № 2

Проведение анализа

1. Сухие пластинки из ацетата целлюлозы помечают карандашом, а затем осторожно кладут на поверхность буфера для электрофореза так, чтобы они поглощали жидкость только снизу с помощью капиллярных сил. При быстром погружении пластинки в буфер в порах ацетата целлюлозы может остаться воздух.

2. Извлекают пластинки из буферного раствора и аккуратно зажимают их между листами плотной фильтровальной бумаги, не допуская высыхания пластинок. О высыхании свидетельствует появление белых пятен на поверхности пластинки. В этом случае пропитывание буфером следует повторить (см. пункт 1).

3. Влажную пластинку закладывают в рамку и помещают в электрофоретическую камеру.

4. С помощью апликатора на поверхность пластинки с катодного краю наносят образец – 0,2-0,4 мл сыворотки крови.

5. Сразу после нанесения образцов включают электрический ток.

Для кратковременного электрофореза на пленках из ацетата целлюлозы лучшие результаты получаются при стабильном напряжении. Как правило, для пластинок толщиной около 120 мкм сила тока не должна превышать 0,5 мА на 1 см ширины пластинки. Для более толстых пластинок (250-300 мкм) сила тока может достигать 1мА на 1 см ширины пластинки. Применив высокий градиент напряжения (30-40 В на 1 см) можно получить четкое разделение фракций белка за короткий промежуток времени (20-30 минут).

 

6. После отключения тока пластинки осторожно переносят в красящий раствор на 5 минут.

7. Затем пластинки отмывают до отбеливания фона в 5-7% растворе уксусной кислоты дважды по 3 минуты. Промывают 3 раза дистиллированной водой. Просушивают между листами фильтровальной бумаги.

8. Проводят просветление пластинок. Для этого помещают пластинки на 30 секунд в 90° этиловый спирт. Затем помещают их в осветляющий раствор на 30 секунд. Наклеивают на стекло и помещают в сухожаровой шкаф на 5 минут при температуре 100°С.

9. Высушенную пластинку сканируют на денситометре придлине волны 600 нм, характерной для красителя амидо черного.

Расчет

Данные о содержании белка в белковых фракциях сыворотки крови могут быть представлены как в форме процентного распределения белка по фракциям, так и в форме содержания белка в отдельных фракциях в г/л (для этого предварительно в крови определяют содержание общего белка биуретовым методом).Результаты измерения заносят в таблицу:

 

Белковые фракции	Нормальные величины, %	Полученные величины, %	Полученные величины, г/л
1. Альбумины	60,2% (50,3-70,1)
2. a1-Глобулины	4,4% (2,7-6,1)
3. a2-Глобулины	12,3% (9,4-15,2)
4. b-глобулины	13,0% (7,7-18,0)
5. g-Глобулины	20,1% (15,2-25,0)
Концентрация общего белка в сыворотке крови – ______ г/л

Клинико-диагностическое значение: Электрофорез белков сыворотки крови имеет диагностическое значение в наблюдении за динамикой патологического процесса и оценке эффективности медикаментозного лечения.

Увеличение содержания a-глобулинов в сыворотке характерно для острых воспалительных заболеваний, так ка в данную фракцию входят белки острой фазы.

Во фракцию a-глобулинов входит также и большинство гликопротеинов крови. Поэтому ее содержание увеличивается при различных хронических заболеваниях, раке, травмах, ревматизме и инфаркте миокарда.

Повышение b-глобулинов в сыворотке чаще наблюдается при гиперлипопротеинемиях различного происхождения, так как в эту фракцию входят липопротеины.

Фракция g-Глобулинов состоит из иммуноглобулинов и увеличивается при заболеваниях, связанных с интенсивными иммунными процессами, а также при миеломных болезнях.

Гипогаммаглобулинемия может носить врожденный характер или быть обусловленной истощением иммунной системы (рак, хронические воспалительные процессы, аллергические заболевания, СПИД).

 

ТЕМА 2. ФЕРМЕНТЫ

Лабораторная работа № 3.

Проведение анализа

Перед проведением анализа реагенты следует прогреть до температуры измерения (37°С).

Добавить в кювету	Опытная проба
1. Сыворотка	25 мкл
2. Рабочий реагент	1 мл

 

Перемешать содержимое пробирки и включить секундомер. Измерить оптическую плотность пробы против дистиллированной воды при длине 340 нм ровно через 2 мин. Повторить измерение 2 раза с интервалом 1 мин. Рассчитать изменение оптической плотности за каждую минуту а затем вычислить среднее измерение оптической плотности в минуту (Dо.п./мин).

 

Расчет

Расчет по фактору активности КК проводят по формуле:

 

Dо.п./мин ´ 1,025 ´ 1000 АКК (Е/л) = ----------------------------------- = Dо.п./мин ´ 6592, 6,22 ´ 0,025 ´ 1,0

 

где Dо.п./мин – среднее изменение опт.плотн. в минуту;

1,025 – общий объем раствора в кювете;

1000 – коэффициент перевода мл в л;

6,22 – коэффициент миллимолярного поглощения НАДН;

0,025 – объем сыворотки в мл;

1,0 – длина оптического пути.

 

При внесении каких-либо изменений в перечисленные параметры фактор следует пересчитать. Если активность КК превышает 1500 Е/л (точка вне зоны линейности калибровочного графика), анализируемую сыворотку следует развести 1:1 физиологическим раствором и повторить измерение, а полученный результат расчета умножить на 2.

 

Клинико-диагностическое значение: Повышение активности КК в сыворотке крови может быть следствием повреждения сердечной или скелетной мускулатуры.

При поражении сердечной мышцы (инфаркт миокарда, миокардит, сердечные аритмии, сердечная недостаточность) активность КК может вырасти в 20-30 раз по сравнению с нормой.

При поражении скелетной мускулатуры уровень активности КК возрастает еще больше.

При инфаркте миокарда, как правило, подъем активности КК наступает через 4-8 часов после начала болевого приступа, достигает максимума через 16-36 часов, и нормализуется к 3-6 дню. МВ-фракция КК является высокоспецифичной для сердечной мышцы, ее активность, как правило, значительно повышается при инфаркте миокарда.

Повышение активности КК может быть вызвано и другими причинами, например: употреблением алкоголя, отравлением снотворным, внутривенным введением ряда лекарственных препаратов.

 

 

 

Лабораторная работа № 4.

Проведение анализа

ПЦР состоит из 3 основных процедур:

1) подготовки исследуемой пробы материала (изоляция ДНК или РНК);

2) собственно ПЦР;

3) детекция продукта ПЦР (амплифицированной ДНК).

Пятью основными компонентами ПЦР являются следующие:

а) фермент Taq -ДНК-полимераза;

б) пара олигонуклеотидных праймеров;

в) 4 типа дезоксинуклеозидтрифосфатов (dАТФ, dГТФ, dЦТФ, dТТФ);

г) копируемая ДНК;

д) ионы Mg⁺².

Вспомогательными компонентами являются буферный раствор и минеральное масло.

Поскольку праймеры каждый раз встраиваются в амплифицируемые фрагменты ДНК-матрицы (амплификоны), то они в реакционной смеси ПЦР присутствуют в избытке.

Как правило, праймеры для ПЦР-детекции инфекционных возбудителей создают на консервативные участки их ДНК, которые редко подвергаются генетическим перестройкам. Поиски таких участков осуществляют при помощи специальных компьютерных программ.

Результаты получают через несколько часов, то есть в течение одного рабочего дня.

Рассмотрим ПЦР-анализ на примере амплификации участка плазмиды pBluescript II SK, размером ~ 180 п.н

 

ПЦР проводится в объеме 10-100 мкл.

Рабочая концентрация праймеров в реакционной смеси составляет 0.2-1 пмоль/мкл

Количество матричной ДНК, добавляемой в реакцию колеблется в пределах от 10 до 1000 нг.

Рабочая концентрация Taq -ДНК-полимеразы в реакционной смеси составляет 0.01-0.05 Е/мкл

Считается, что "скорость" достраивания у Taq -ДНК-полимеразы составляет 1000 нуклеотидов в минуту

Методика:

1. В стерильном эппендорфе на 0,5 мл смешать указанные выше компоненты, довести объем при помощи деионизованной воды до 20 мкл, аккуратно перемешать реакционную смесь пипетированием.

2. Наслоить на реакционную смесь немного минерального масла (приблизительно 30 мкл).

3. Поместить пробирки в амплификатор. Реакцию проводить в следующем режиме:

 

Температура, С	Стадия	Время	Число циклов
	Денатурация	40 сек
	Отжиг	30 сек
	Элонгация	30 сек
		10 мин
		хранение

 

4. Детекция продуктов амплификации проводится методом электрофореза на агарозном геле.

Анализ продуктов ПЦР должен производиться в изолированной комнате сотрудником лаборатории, не производящим обработки клинических образцов и операций с реакционной смесью.

Работать следует только в одноразовых перчатках и сменной обуви.

Чувствительность ПЦР может достигать математически возможного предела (детекция 1 копии ДНК-матрицы), поэтому существует высокая степень опасности получения ложно-положительного результата в силу переноса через предметы и реагенты как самой ДНК-матрицы (реже), так и аплификонов (очень часто), получаемых в больших количествах во многих пробирках в течение ежедневной работы. В связи с этим нами разработаны специальные требования к планировке и режиму работы ПЦР-генодиагностической лаборатории. Поэтому детекция продуктов ПЦР должна проводиться в изолированной комнате сотрудником, не производящим обработку клинических образцов и не готовящим реактивы для ПЦР. Приготовление основных растворов также должно производится в отдельной чистой комнате. Все растворы должны храниться и использоваться в небольших порциях.

Клинико-диагностическое значение: ПЦР в настоящее время является наиболее совершенным диагностическим методом, позволяющим выявлять единичные клетки возбудителей многих инфекционных заболеваний за счет амплификации специфических для этих возбудителей фрагментов ДНК.

ПЦР позволяет обнаруживать патогенные для человека бактерии и вирусы даже в тех случаях, когда другими способами (иммунологическим, бактериологическим, микроскопическим) их выявление невозможно.

Тест-системы на основе ПЦР эффективны при диагностике трудно культивируемых, не культивируемых и персистирующих форм патогенных бактерий. С этим приходится сталкиваться при латентных и хронических инфекциях, а также при тестировании объектов внешней среды.

Метод позволяет определять число копий возбудителя в пробе и тем самым контролировать виремию или бактеремию в процессе лечения.

Метод также пригоден для выявления носителей дефектных генов (например ген НbS серповидно-клеточной анемии).

ПЦР-диагностикумы, в отличие от иммунологических тест-систем, позволяют избежать проблем, связанных с перекрестно-реагирующими антигенами, тем самым обеспечивая абсолютную специфичность определения патогенного организма.

 

 

ЭНЕРГЕТИЧЕСКИЙ ОБМЕН

Лабораторная работа № 5

Проведение анализа

Добавить в кювету	Опытная проба	Холостая проба
1. Ортофосфорная кислота	1 мл	1 мл
2. Сыворотка	100 мкл	--
3. Дистиллированная вода	--	100 мкл
4. Реагент	400 мкл	400 мкл
Пробирки накрыть колпачками и поместить в водяную баню на 45 мин при 100°С. После кипячения пробирки охладить в холодной воде 3-5 минут.
5. п -Бутанол	1,5 мл	1,5 мл

 

Перемешать содержимое в пробирках, интенсивно встряхивая их до образования однородной белой суспензии розового оттенка. Затем пробирки центрифугировать 10 мин при 3000 об/мин. Сразу после центрифугирования отобрать по 1 мл супернатанта в чистые пробирки. Измерить оптическую плотность опытной пробы против холостой пробы при двух длинах волн 535 нм и 570 нм в кювете с толщиной слоя 1 см. Окраска раствора стабильна в течение 1,5 часа после центрифугирования.

 

Расчет

Расчет содержания продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке проводят по формуле:

 

А535 – А570 С (мкмоль/л) = ------------------------- ´ 15, 0,156

где А₅₃₅ и А₅₇₀ – опт.плотность пробы при длине волны 535 нм и 570 нм,

соответственно;

0,156 – коэффициент молярной экстинции комплекса малонового

альдегида с тиобабитуровой кислотой;

15 – коэффициент разведения сыворотки.

 

Клинико-диагностическое значение: Образующиеся в процессе развития ПОЛ ненасыщенные альдегиды и малоновый альдегид являются мутагенами и обладают выраженной цитотоксичностью: подавляют активность гликолиза и окислительного фосфорилирования, ингибируют синтез белка и нуклеиновых кислот, окисляют белковые SH-группы, ингибируют различные цитозольные и мембраносвязанные ферменты.

 

Лабораторная работа № 6.

Проведение анализа

1. Включить прибор. На экране автоматически появится результат предыдущего теста.

2. Установить код нажатием кнопки «С». Номер кода на приборе должен совпадать с номером кода на флаконе с тест-полосками.

3. Ввести тест-полоску в прибор до упора.

4. Проколоть палец с помощью нового стерильного ланцета.

5. Аккуратно нанести каплю крови на зону теста.

6. Получить точный результат через 45 секунд (дата, время, уровень глюкозы в ммоль/л).

 

Хотя система ONE TOUCH BASIC PLUS требует малого количества крови, очень важно, чтобы капля крови была достаточно большой и закрывала полностью зону теста.

Данный прибор не предназначен для диагностики сахарного диабета и для измерения уровня глюкозы в крови у новорожденных детей в возрасте до 4 недель.

Если результаты анализа ниже 3,3 ммоль/л, на экране появится надпись «опасно врач» – следует немедленно принять меры вместе с лечащим врачем при гипогликемии.

Если результат выше 33,3 ммоль/л, на экране прибора появится надпись «НI опасно врач», что указывает на недопустимо высокую концентрацию глюкозы в крови (острая гипергликемия) и требуется немедлнное обращение к врачу.

 

Для проверки правильности показаний прибора (минимум 1 раз в неделю) можно использовать проверочную тест-полоску или контрольный раствор:

 

 

Контроль с помощью проверочной тест-полоски	Контроль с помощью контрольного раствора
1. Включить прибор	1. Включить прибор
2. Ввести проверочную полоску стороной 1 вверх	2. Убедится, что номер на экране совпадает с номером на флаконе с тест-полосками. Вставить тест-полоску.
3. При появлении записи на экране «Нанеси пробу» извлечь проверочную полоску	3. Хорошо встряхнуть флакон с контрольным раствором.
4. Когда на экране прибора появится надпись «введи стор.2», ввести проверочную полоску стороной 2.	4. Нанести каплю контрольного раствора на зону теста
5. Прибор покажет результат.	5. Прибор покажет результат через 45 секунд.

 

Клинико-диагностическое значение: Увеличенные уровни глюкозы в крови (гипергликемия) характерны для сахарного диабета, гиперфункции щитовидной железы, гипофиза и надпочечников.

Концентрация глюкозы в крови ниже нормы (гипогликемия) наблюдается при инсулин-секретирующих опухолях, микседеме, гипофункции гипофиза, гипофункции надпочечников, и в случае введения пациенту сверхбольшой дозы инсулина.

 

Лабораторная работа № 7.

Проведение анализа

Перед проведением анализа рабочий реагент следует прогреть до температуры измерения (37°С).

 

Добавить в кювету	Опытная проба
1. Сыворотка	25 мкл
2. Рабочий реагент	1 мл

 

Перемешать содержимое пробирки и включить секундомер. Измерить оптическую плотность пробы против дистиллированной воды при длине 340 нм ровно через 1 мин. Повторить измерение 3 раза с интервалом 1 мин. Рассчитать изменение оптической плотности за каждую минуту, а затем вычислить среднее измерение оптической плотности в минуту (Dо.п./мин).

 

Расчет

Расчет по фактору активности ЛДГ проводят по формуле:

 

Dо.п./мин ´ 1,025 ´ 1000 АЛДГ (Е/л) = ----------------------------------- = Dо.п./мин ´ 6592, 6,22 ´ 0,025 ´ 1,0

 

где Dо.п./мин – среднее изменение оптической плотности в минуту;

1,025 – общий объем раствора в кювете;

1000 – коэффициент перевода мл в л;

6,22 – коэффициент миллимолярного поглощения НАДН;

0,025 – объем сыворотки в мл;

1,0 – длина оптического пути.

При внесении каких-либо изменений в перечисленные параметры фактор следует пересчитать. Если активность ЩФ превышает 800 Е/л (точка вне зоны линейности калибровочного графика), анализируемую сыворотку следует развести 1:1 физиологическим раствором и повторить измерение, а полученный результат расчета умножить на 2.

 

Клинико-диагностическое значение: Активность ЛДГ в сыворотке крови повышается при различных заболеваниях (инфаркт миокарда, лейкозы, заболевания почек, инфекционный мононуклеоз, повреждение паренхимы печени, мышечные дистрофии, опухолевые новообразования).

Из-за отсутствия органной специфичности ЛДК в диагностике чаще применяют определение активности ее изоферментов, чем общую активность ЛДГ.

Общая активность ЛДГ в сыворотке при инфаркте миокарда достигает максимума через 24-36 часов после начала болевого приступа, но приходит к норме медленнее, по сравнению с КК и АСТ, на 8-10 день.

Увеличение активности в сыворотке изофермента ЛДГ1 специфично для поражения миокарда. Для заболеваний скелетной мускулатуры характерно повышение изофермента ЛДГ5. Заболевания печени сопровождаются разными изоферментными спектрами ЛДГ: для острого гепатита характерно резкое увеличение ЛДГ5 и ЛДГ4 и уменьшение ЛДГ1 и ЛДГ2; при циррозе увеличена активность ЛДГ5; при холецистите активность ЛДГ5 увеличена незначительно.

В опухолевых тканях преобладают изоформы ЛДГ5 и ЛДГ4. При лейкозах обнаружена корреляция активности ЛДГ2 и ЛДГ3 от количества незрелых клеток.

 

Лабораторная работа № 8.

Проведение анализа

Добавить в пробу:	Холостая проба	Калибровочная проба	Опытная проба
1. Калибратор	--	10 мкл	--
2. Сыворотка	--	--	10 мкл
3. Реагент	1 мл	1 мл	1 мл

 

Перемешать тщательно содержимое пробирок и инкубировать при температуре 37°С в течение 5 минут или при комнатной температуре (18-25°С) – в течение 15 минут. Измерить оптическую плотность опытной (D_оп) и калибровочной (D_калиб) проб против холостой пробы при длине волны 540 нм. Окраска раствора стабильна в течение 30 минут.

 

Расчет

Содержание триацилглицеролов в сыворотке рассчитывают по стандарту (калибратор) по формуле:

 

Аоп С (ммоль/л) = ------------ ´ Скалиб, Акалиб

 

где С – концентрация триацилглицеролов в анализируемой пробе, ммоль/л;

А_оп – оптическая плотность опытной пробы;

А

 

_калиб – оптическая плотность калибровочной пробы;

С_калиб – концентрация триацилглицеролов в калибраторе, ммоль/л.

При содержании триацилглицеролов в пробе свыше 11,4 ммоль/л (точка вне зоны линейности калибровочного графика), анализируемую сыворотку следует развести 1:1 физиологическим раствором и повторить измерение, а полученный результат расчета умножить на 2.

 

Клинико-диагностическое значение: ТАГ определяют для типирования эссенциальных гиперлипопротеинемий. Например, гиперлипопротеинемия типа IIA отличается высоким уровнем холестерина в сыворотке по сравнению с типом IIB, для которой характерно высокие уровни холестерина и ТАГ.

Повышение уровня ТАГ в сыворотке бывает и при других заболеваниях (переломы костей, нефротический синдром, гипотиреоз, алкоголизм), но диагностического значения в этих случаях не имеет.

Иногда, при несвоевременном заборе биоматериала, можно обнаружить алиментарную гипертриглицеридемию, характеризующуюся высокими концентрациями ТАГ после приема жирной пищи.

 

Лабораторная работа № 9.

Проведение анализа

Добавить в кювету	Опытная проба	Холостая проба	Стандартная проба
1. Сыворотка	10 мкл	--	--
2. Стандарт	--	--	10 мкл
3. Дистиллиро-ванная вода	--	10 мкл	--
4. Реагент	1 мл	1 мл	1 мл

 

Перемешать содержимое каждой пробирки. Инкубировать 10 мин при температуре 37°С. Измерить оптическую плотность опытной и стандартной проб против холостой пробы при длине волны 550 нм (DА). Окраска стабильна в течение 30 минут.

 

Расчет

Расчет по стандарту концентрации холестерола в сыворотке проводят по формуле:

 

DАоп С (ммоль/л) = ----------- ´ Сст, DАст

где DА_{оп / ст} – оптическая плотность опытной пробы и стандартной,

соответственно;

С_ст – концентрация стандарта (ммоль/л).

 

Если концентрация холестерола превышает 19,4 ммоль/л (точка вне зоны линейности калибровочного графика), анализируемый образец (сыворотка или моча) следует развести 1:1 физиологическим раствором и повторить измерение, а полученный результат расчета умножить на 2.

 

Клинико-диагностическое значение: Уровни холестерола важны в диагностике и классификации гиперлипопротеинемий.

Концентрация холестерина в сыворотке указывает на работу печени, билиарного тракта, всасывание в кишечнике.

Высокие концентрации холестерина говорят об угрозе ишемической болезни сердца, о нарушении тиреоидной функции и заболеваниях надпочечников.

 

 

Лабораторная работа № 10.

Проведение анализа

 

В пластиковую пробирку внести 400 мкл сыворотки и добавить 2 мл осаждающего реагента. Тщательно перемешать в течение 15 секунд. После чего центрифугировать 3000 об/мин в течение 5 минут. Отобрать 1мл супернатанта в чистую пробирку и использовать для последующего определения холестерола в ЛПВП.

Добавить в кювету	Опытная проба	Холостая проба	Стандартная проба
1. Супернатант	10 мкл	--	--
2. Стандарт	--	--	10 мкл
3. Дистиллиро-ванная вода	--	10 мкл	--
4. Реагент	1 мл	1 мл	1 мл

 

Перемешать содержимое каждой пробирки. Инкубировать 10 мин при температуре 37°С. Измерить оптическую плотность опытной и стандартной проб против холостой пробы при длине волны 550 нм (DА). Окраска стабильна в течение 30 минут.

 

 

Расчет

Расчет по стандарту концентрации холестерола в сыворотке проводят по формуле:

 

DАоп С (ммоль/л) = ----------- ´ Сст, DАст

где DА_{оп / ст} – оптическая плотность опытной пробы и стандартной,

соответственно;

С_ст – концентрация стандарта (ммоль/л).

 

Общий холестерол сыворотки
Норма	Пограничные значения	Высокий уровень
< 5,2 ммоль/л	5,2-6,1 ммоль/л	> 6,2 ммоль/л
Холестерол ЛПВП
Норма	Пограничные значения	Низкий уровень
> 0,9 ммоль/л	> 0,9 ммоль/л; < 0,9 ммоль/л	< 0,9 ммоль/л

 

Клинико-диагностическое значение: Содержание холестерола в ЛПВП в кови здоровых людей мало меняется с возрастом и не подвержено колебаниям.

Величины содержания холестерола в ЛПВП < 0,9 ммоль/л свидетельствуют о нарушении липидного обмена и угрозе атеросклероза. Повышение содержания холестерола в ЛПВП, как и повышение содержания общего холестерина в результате увеличения этой фракции, является доброкачественным состоянием.

 

ТЕМА 7. БЕЛКОВЫЙ ОБМЕН

Лабораторная работа № 11.

Проведение анализа

Перед проведением анализа реагенты следует прогреть до температуры измерения (37°С).

Добавить в кювету	Опытная проба
1. Сыворотка	100 мкл
2. Монореагент	1 мл

Перемешать содержимое пробирки и включить секундомер. Измерить оптическую плотность пробы против воздуха при длине 340 нм ровно через 1 минуту. Повторить измерение 3 раза с интервалом 1 мин. Рассчитать изменение оптической плотности за каждую минуту а затем вычислить среднее измерение оптической плотности в минуту (Dо.п./мин).

Расчет

Расчет по фактору активности АЛТ проводят по формуле:

Dо.п./мин ´ 1,100 ´ 1000 ААЛТ (Е/л) = ----------------------------------- = Dо.п./мин ´ 1745, 6,30 ´ 0,100 ´ 1,0

где Dо.п./мин – среднее изменение оптической плотности в минуту;

1,100 – общий объем раствора в кювете в мл;

1000 – коэффициент перевода мл в л;

6,30 – коэффициент миллимолярного поглощения НАДН;

0,100 – объем сыворотки в мл;

1,0 – длина оптического пути.

Значение фактора для расчета активности АЛТ можно взять из таблицы:

Длина волны	Температура реакции 25-30°С	Температура реакции 37°С
340 нм
334 нм
365 нм

 

При внесении каких-либо изменений в перечисленные параметры фактор следует пересчитать.

Если активность АЛТ превышает 280 Е/л (точка вне зоны линейности калибровочного графика), анализируемую сыворотку следует развести 1:9 физиологическим раствором и повторить измерение, а полученный результат расчета умножить на 10.

 

Клинико-диагностическое значение: АЛТ в высоких концентрациях присутствует в клетках печени и в меньшей степени в скелетных мышцах, почках и сердце.

Наиболее часто повышение активности АЛТ в сыворотке отмечается при острых заболеваниях печени и желчных путей. У больных острыми вирусными гепатитами активность фермента резко повышается в ранние сроки болезни, обычно за 5-2 дня до появления желтухи. Пик активности АЛТ приходится на момент появления желтухи и нормализуется к исходу 8-й недели болезни. Длительное незначительное увеличение активности АЛТ в сыворотке часто свидетельствует о хроническом процессе заболевания (хронический гепатит, цирроз.

 

Лабораторная работа № 12.

Проведение анализа

Перед проведением анализа реагенты следует прогреть до температуры измерения (37°С).

 

Добавить в кювету	Опытная проба
1. Сыворотка	100 мкл
2. Реагент	1 мл

 

Перемешать содержимое пробирки и включить секундомер. Измерить оптическую плотность пробы против дистиллированной воды при длине 340 нм ровно через 1 минуту. Повторить измерение 3 раза с интервалом 1 мин. Рассчитать изменение оптической плотности за каждую минуту а затем вычислить среднее измерение оптической плотности в минуту (Dо.п./мин).

 

Расчет

Расчет по фактору активности АСТ проводят по формуле:

Dо.п./мин ´ 1,1 ´ 1000 ААСТ (Е/л) = ----------------------------------- = Dо.п./мин ´ 1768, 6,22 ´ 0,1 ´ 1,0

где Dо.п./мин – среднее изменение оптической плотности в минуту;

1,1 – общий объем раствора в кювете в мл;

1000 – коэффициент перевода мл в л;

6,22 – коэффициент миллимолярного поглощения НАДН;

0,1 – объем сыворотки в мл;

1,0 – длина оптического пути.

 

При внесении каких-либо изменений в перечисленные параметры фактор следует пересчитать.

Если активность АСТ превышает 300 Е/л (точка вне зоны линейности калибровочного графика), анализируемую сыворотку следует развести 1:1 физиологическим раствором и повторить измерение, а полученный результат расчета умножить на 2.

Клинико-диагностическое значение: АСТ в высоких концентрациях присутствует в клетках сердечной мышцы, печени, почках и эритроцитах. Поражение любого из этих органов и тканей может привести к значительному повышению активности АСТ в сыворотке.

Наиболее резкие изменения в каталитической концентрации АСТ наблюдаются при поражении сердечной мышцы. При остром инфаркте миокарда увеличение активности АСТ обычно начинается через 6-12 часов после возникновения боли, достигает максимума через 24-48 часов, а затем постепенно падает, возвращаясь в норму через 4-5 дней с начала приступа. Если в течение нескольких дней нормализации активности фермента не происходит, то это свидетельствует о расширении зоны инфаркта и является плохим прогностическим признаком.

Умеренное повышение активности АСТ в сыворотке характерно для хронических и инфильтративных болезней печени (цирроз, механическая желтуха, метастазы опухоли в печени), а также при поражении скелетной мускулатуры (прогрессирующая мышечная дистрофия, разможжение мышц, травма).

Коэффициент Де Ритиса

Коэффициент Де Ритиса – это отношение активностей АСТ/АЛТ. В норме он равен 0,6-0,8.

При вирусных гепатитах его значения варьируют в пределах 0,2-0,5. В разгар болезни коэффициент Де Ритиса может вырасти до 1,0 (активности АСТ и АЛТ очень высоки) и выше – это плохой прогностический признак, свидетельствующий о наступлении дистрофии печени.

Значение коэффициента Де Ритиса при обтурационных желтухах, циррозах и хронических заболеваниях печени, как правило, > 1, при этом наблюдается незначительное повышение активности ферментов АСТ и АЛТ.

 

Лабораторная работа № 13.

Проведение анализа

Добавить в кювету	Опытная проба	Холостая проба	Стандартная проба
1. Сыворотка	10 мкл	--	--
2. Стандарт	--	--	10 мкл
3. Дистиллиро-ванная вода	--	10 мкл	--
4. Реагент	1 мл	1 мл	1 мл

 

Перемешать содержимое каждой пробирки. Инкубировать 20 мин при температуре 37°С. Измерить оптическую плотность опытной и стандартной проб против холостой пробы при длине волны 500-650 нм.

 

Расчет

Расчет по стандарту концентрации мочевины в сыворотке крови проводят по формуле:

 

DАоп С (ммоль/л) = ----------- ´ Сст, DАст

 

где DА_{оп / ст} – оптическая плотность опытной и стандартной проб,

соответственно;

С_ст – концентрация стандарта (ммоль/л).

 

Если концентрация мочевины превышает 26,8 ммоль/л (точка вне зоны линейности калибровочного графика), анализируемый образец (сыворотка или моча) следует развести 1:1 физиологическим раствором и повторить измерение, а полученный результат расчета умножить на 2.

 

Клинико-диагно