Тема 5. Физиологические основы методов исследования групп крови

Мотивационная характеристика темы. Знание учения о группах крови необходимо для понимания принципов переливания крови и методов постановки проб совместимости перед переливанием.

Цели занятия: знать – 1) характеристику групповых систем крови; 2) физиологические механизмы, лежащие в основе постановки проб перед переливанием крови.

ВОПРОСЫ ДЛЯ УСТНОГО И ТЕСТОВОГО КОНТРОЛЯ:

1. Виды антигенных систем крови и их характеристика.

2. Клиническое значение антигенных систем АВО и Rh.

3. Условия развития реакции гемагглютинации.

4. Современные требования к переливанию крови.

5. Пробы перед переливанием крови, их последовательность.

6. Определение групп крови в системе АВО с помощью стандартных сывороток и цоликлонов.

7. Определение резус принадлежности, значение при беременности и при переливании крови.

ВОПРОСЫ ДЛЯ ПИСЬМЕННОГО ОТВЕТА:

1. Перечислите антигенные системы крови.

2. Напишите номенклатурные названия групп крови антигенных систем АВО и Rh.

3. Опишите характеристики агглютининов систем АВО и Rh.

4. Опишите методики определения групп крови в системе АВО.

5. Опишите методики определения Rh-принадлежности человека и определения антител Rh- в крови резус-отрицательных людей.

6. Опишите пробы, которые необходимо проводить прежде чем перелить кровь.

7. Охарактеризуйте стандартные сыворотки и цоликлоны.

8. Нарисуйте возможные реакции при определении групп крови с помощью стандартных сывороток и цоликлонов.

ПРОГРАММА ПРАКТИЧЕСКОЙ РАБОТЫ НА ЗАНЯТИИ.

1. Определение группы крови по системе АВО с помощью стандартных сывороток.

2. Определение группы крови по системе АВО с помощью цоликлонов.

3. Определение групп крови по системе Rh(D) с помощью анти-D- моноклональных антител.

4. Экспресс-методика определения групп крови по системе ABO+D с помощью моноклональных антител.

5. Ознакомление с мероприятиями, проводимыми перед переливанием крови.

Методика определения групп крови по системе АВО с помощью стандартных сывороток.

Стандартные сыворотки – это очищенная в фабричных условиях плазма доноров разных групп крови, не содержащая фибриногена, с высокой концентрацией антител к одному или нескольким антигенам одной групповой системы.

Для работы необходим ы: скарификаторы, две стеклянные палочки, стандартные сыворотки I – IV групп, планшет с нанесенными на нем обозначениями агглютининов сывороток и специальными углублениями, ватные шарики, спирт, специальный капилляр. Объект исследования – человек.

Проведение работы: На поверхность каждого углубления соответственно обозначениям наносят большую каплю стандартной сыворотки соответствующей группы (две серии каждой группы в два ряда). Для взятия сывороток из ампул применяют специальные стеклянные палочки. Нельзя допускать смешивания сывороток. Получают кровь из пальца и чистым концом палочки вносят каплю крови (в 10 раз меньше по объему) в каждую из капель сывороток. Для каждой капли крови используют другие (чистые) стеклянные палочки. Слегка покачивая тарелку в течение 5 мин, наблюдают за каплями. Агглютинация видна в форме мелких красных крупинок, постепенно увеличивающихся в размерах на фоне светлеющей смеси. На 4-й мин к каждой капле, где наблюдается агглютинация, добавляют каплю физиологического раствора. На основании наличия или отсутствия агглютинации делают вывод о группе исследуемой крови. Группа О (I) содержит только агглютинины α, β. Группа А (II) содержит агглютининогены А и агглютинины β. Группа В (III) содержит агглютининогены В и агглютинины α. Группа АВ (IV) содержит агглютининогены А и B, агглютининов нет.

Оформление результатов и их оценка: Записать полученные результаты определения исследуемой группы крови: 1. Если агглютинация не наблюдается ни в одной из исследуемых капель, это свидетельствует об отсутствии агглютининогенов в эритроцитах исследуемой крови и, следовательно, кровь принадлежит к группе I (0). 2. Если агглютинация произошла с сыворотками I и III групп, содержащими соответственно агглютинины α, β и α, а сыворотки II и IV групп дали негативный результат, то эритроциты исследуемой крови содержат агглютининогены А, и эта кровь принадлежит ко II (А) группе. 3. Если агглютинация произошла с сыворотками I и II групп, содержащими агглютинины α, β и β, а сыворотки III и IV групп дали негативный результат, то эритроциты исследуемой крови содержат агглютининоген В, и она принадлежит к III (В) группе. 4. Если агглютинация произошла с сыворотками I, II, III групп, содержащими соответсвтенно агглютинины α, β, β, α, а сыворотка IV группы дала негативный результат, то эритроциты исследуемой крови содержат как агглютининоген А, так и агглютининоген В. Следовательно, исследуемая кровь принадлежит к IV (AB) группе.

 

Агглютининогены эритроцитов	Агглютинины сывороток	Група крови
α β	β	α
-	-	-	-	-	0αβ (I)
А	+	-	+	-	Aβ (II)
В	+	+	-	-	Bα (III)
АВ	+	+	+	-	AB (IV)

 

Возможные Ошибки при определении групп крови

Отсутствие агглютинации может наблюдаться в следствие:

- ошибочного соотношения исследуемой крови и стандартной сыворотки

- слабого титра стандартных сывороток

- гемолиза эритроцитов исследуемого

- определение проводилось при высокой температуре окружающей среды (более 25%) и срок меньше, чем 5 мин.

Наряду с отсутствием агглютинации в ряде случаев может наблюдаться ложная агглютинация. Краевая агглютинация наблюдается при подсыхании капель, если определение группы крови превышает 5 мин. Холодовая агглютинация происходит, если определение проводят при температуре ниже 15⁰С. При добавлении подогретого до комнатной температуры физиологического раствора холодовая агглютинация исчезает. Бактериальная агглютинация – агрегация эритроцитов вокруг бактерий, что может наблюдаться при работе с недоброкачественными сыворотками.

МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГРУПП КРОВИ ПО СИСТЕМЕ АВО С ПОМОЩЬЮ ЦОЛИКЛОНОВ

Цоликлоны анти-А и анти-В - это специфические иммуноглобулины, т.е. антитела (агглютинины) к групповым антигенам А и В, которые образуются одноклональными В-лимфоцитами в ответ на введение антигенов А или В. Они обладают строгой специфичностью, т.е. не приводят к неспецифической полиагглютинации эритроцитов. Это свойство обеспечивает их преимущество перед стандартными сыворотками, которые тяжело очистить от других антител и соответственно предотвратить неспецифические реакции с антигенами исследуемой крови.

Для работы необходим ы: скарификаторы, стеклянная палочка, цоликлоны анти-А (розового цвета), цоликлоны анти-В (синего цвета), стандартные Er I – IV групп, планшет, ватные шарики, спирт. Объект исследования – человек.

Проведение работы: Цоликлоны анти-А и анти-В наносят на планшет по одной большой капле (0,1 мл) под соответствующими надписями: анти-А и анти-В. Рядом с каплями антител наносят исследуемую кровь (с большим количеством эритроцитов – первые капли из пальца или свободные эритроциты из осадка свернувшийся крови) по одной маленькой капле, в 10 раз меньшей капли антител (0,01 мл). Сухой стеклянной палочкой смешивают капли крови и антител, меняя конец палочки перед размешиванием каждой капли. Наблюдают за ходом реакции, покачивая планшет в течение 2,5 мин. Положительный результат наблюдается при возникновении реакции агглютинации и образовании хлопьев склеивающихся эритроцитов и антител. Отрицательный результат наблюдается при отсутствии реакции агглютинации. Агглютинация обычно наступает в первые 3-5 сек. При наличии в крови слабых антигенов А или В агглютинация может наблюдаться в течение 2,5 мин.

Оформление результатов и их оценка: Записать полученные результаты определения исследуемой группы крови в виде таблицы:

№	Реакция исследуемых Er с цоликлоном анти-А и анти-В	Реакция исследуемой плазмы (сыворотки) со стандартными Er группы	Исследуемая кровь принадлежит к группе
	Анти- А	Анти-В	А (II)	B (III)
1.	-	-	+	+	0 (I)
2.	+	-	-	+	A (II)
3.	-	+	+	-	B (III)
4.	+	+	-	-	AB (IV)

1. Если агглютинация не наблюдается ни в одной из исследуемых капель, это свидетельствует об отсутствии агглютининогенов в эритроцитах исследуемой крови и, следовательно, кровь принадлежит к группе I (0). Это подтверждается наличием агглютининов α и β в исследуемой плазме (сывротке) по результатам положительной реакции агглютинации со стандартными Er групп А (II) и В (III). 2. Если агглютинация произошла только с цоликлоном анти-А, исследуемые Er принадлежат к группе А (II). Это подтверждается наличием агглютининов β в исследуемой плазме (сывротке) по результатам положительной реакции агглютинации со стандартными Er групп В (III). 3. Если агглютинация произошла только с цоликлоном анти-В, исследуемые Er принадлежат к группе В (III). Это подтверждается наличием агглютининов α в исследуемой плазме (сывротке) по результатам положительной реакции агглютинации со стандартными Er групп А (II). 4. Если агглютинация произошла как с цоликлоном анти-А так и с цоликлоном анти-В, исследуемые Er принадлежат к группе АВ (IV). Это подтверждается отсутствием агглютининов α и β в исследуемой плазме (сывротке) по результатам отрицательной реакции агглютинации со стандартными Er групп А (II) и В (III).

МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГРУПП КРОВИ ПО СИСТЕМЕ Rh(D) С ПОМОЩЬЮ АНТИ–D- МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

Для работы необходим ы: скарификаторы, стеклянная палочка, анти-D моноклональные антитела, планшет, ватные шарики, спирт, специальный капилляр. Объект исследования – человек.

Проведение работы: На тарелку нанести 1 каплю анти-D- моноклональных антител и 1 каплю исследуемой крови в соотношении 10:1, смешать стеклянной палочкой и наблюдать на протяжении 2,5 мин. По истечении данного времени в капле крови с резус-позитивными эритроцитами наблюдается агглютинация, наличие которой оценивается визуально. Наличие агглютинации указывает на то, что образец исследуемой крови резус-позитивный. Если капля смеси остается равномерно окрашенной и не наблюдаются признаки агглютинации, исследуемая кровь является резус-негативной.

Оформление результатов и их оценка: Записать полученные результаты определения исследуемой группы крови.

ЭКСПРЕСС-МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГРУПП КРОВИ ПО СИСТЕМЕ АВО+D С ПОМОЩЬЮ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ

Методика рекомендуется для определения групп крови по системе А, В, О и Rh (D) у постели больного при необходимости предварительного определения либо непосредственно перед переливанием и не требует обязательного использования контрольных реагентов. Результаты на карточках могут храниться непосредственно в месте определения при комнатной температуре.

Для работы необходим ы: скарификаторы, ватные шарики, спирт, 0,9% натрия хлорид, дозирующие пипетки, две стеклянные палочки, карточки с моноклональными антителами. Объект исследования – человек.

Проведение работы: С помощью дозирующих пипеток поместить одну каплю 0,9 % раствора натрия хлорида и одну каплю крови в зоны определения и аутоконтроля. С помощью чистых концов стеклянных палочек тщательно смешать кровь с высушенными антисыворотками в каждом поле до образования гомогенной реакционной массы. Круговыми движениями карточки в течение 30 сек добиться перемешивания реакционной смеси и осуществления реакции.

Оформление результатов и их оценка: Записать полученные результаты определения исследуемой группы крови. Оставить карточку при комнатной температуре до полного высыхания. После высыхания для адекватного долговременного хранения, накрыть карточку прозрачной самоклеющейся пленкой. Таким образом, результаты могут быть прикреплены в историю болезни и храниться без деконтаминации и повреждения.