Пряма корекція мутаційних пошкоджень

Пряма репарація – це найбільш простий шлях усунення пошкоджень ДНК, в якому задіяні специфічні ферменти, здатні швидко (зазвичай в одну стадію) усувати відповідне пошкодження, відновлюючи вихідну структуру нуклеотидів. Таким чином діє, наприклад, метилгуанін-ДНК-метилтрансфераза, яка знімає метильну групу з азотистої основи на один з власних залишків цистеїну. У підтримці високої точності реплікації важлива роль належить передусім ДНК-полімеразі.

1.1. Похибки реплікації. Самокорекція ДНК-полімеразою

Точність реплікації ДНК дуже велика, але приблизно один раз на 10⁵-10⁶ нуклеотидних залишків відбуваються помилки спаровування, і тоді замість пари нуклеотидів А-Т, G-C у дочірній ланцюг ДНК включаються нуклеотиди, некомплементарні нуклеотидам матричного ланцюга. Незважаючи на ефективність самокорекції, в ході реплікації після подвоєння ДНК в ній виявляються помилки. Найчастіше це спостерігається при порушенні концентрації чотирьох нуклеозидтрифосфатів у субстраті. Значна частина змін виникає в молекулах ДНК в результаті спонтанних процесів, пов'язаних з втратою пуринових основ - аденіну і гуаніну – апуринізацією, або внаслідок дезамінування цитозину, який перетворюється в урацил. Частота останніх змін досягає 100 на 1 геном/добу.

Самокорекція – це відщеплення ДНК-полімеразою помилково включеного в ланцюг ДНК нуклеотиду, не спареного з матрицею (рис.1) і приєднання комплементарного нуклеотиду.

Рис. 1. - Схема процесу корекції при синтезі ДНК.1 – включення в ланцюг ДНК нуклеотида із зміненою (таутомерною) формою цитозину, що «незаконно» парується з аденіном;
2 – швидкий перехід цитозина в звичайну форму порушує його парування з аденіном; неспарований 3′-ОН-кінець ланцюгу, що синтезується, перешкоджає подальшому його подовженню під дією ДНК-полімерази; 3 – ДНК-полімераза видаляє незаконний нуклеотид, у результаті чого знов зявляється спарований із матрицею 3′-ОН-кінець; 4 – ДНК -полімераза продовжує нарощування ланцюга на 3′-ОН-кінці.

Цей фермент здійснює добір необхідних нуклеотидів із наявних в нуклеоплазмі нуклеозидтрифосфатів (АТФ, ТТФ, ГТФ, ЦТФ), їх приєднання до матричного ланцюга ДНК і хімічно зв'язує в зростаючий дочірній ланцюг. Частота включення неправильних нуклеотидів на цій стадії становить 1∙10-5 пар основ. Це відбувається через виникнення хімічно змінених форм азотистих основ, які утворюють «незаконні» пари з основами материнського ланцюга. Наприклад, змінена форма цитозину замість гуаніну зв'язується водневими зв'язками з аденіном. У результаті в зростаючий ланцюг ДНК включається помилковий нуклеотид. Швидкий перехід зміненої форми такої основи в звичайну порушує її зв'язування з матрицею, з'являється неспарений 3'-ОН-кінець зростаючого ланцюга ДНК. У цій ситуації включається механізм самокорекції, що здійснюється ДНК-полімеразою (або тісно пов'язаним з нею ферментом - редагуючою ендонуклеазою). Самокорекція передбачає відщеплення помилково включеного в ланцюг ДНК нуклеотиду, не спареного з матрицею.

Встановлено, що більшість бактеріальних полімераз крім полімеризуючої активності в напрямку 5'→3' мають ще й екзонуклеазну активність у напрямку 3'→5'. Якщо вбудовується «неправильний» нуклеотид, помилка найчастіше (хоча не завжди) розпізнається полімеразою, ймовірно внаслідок того, що в цьому місці у подвійній спіралі утворюється міхур або впинання. «Неправильний» нуклеотид не може сформувати водневий зв'язок з комплементарною основою. Тому полімераза не може додати новий нуклеотид до зростаючого 3'-кінця. Процес реплікації зупиняється доти, поки «неправильний» нуклеотид не буде видалений полімеразою і на його місце нею не буде поставлений потрібний. Наслідком самокорекції є зниження частоти помилок в 10 разів (з 10-5 до 10-6).

В еукаріотичних ДНК-полімераз такої 3'→5'-екзонуклеазної активності не виявлено. В еукаріотів ДНК-полімерази δ, ε здатні після приєднання чергового нуклеотида в зростаючий ланцюг ДНК робити крок назад (в напрямку від 3'до 5'- кінця) і вирізати останній нуклеотид, якщо він некомплементарний нуклеотиду в матричному ланцюзі ДНК. Цей процес виправлення помилок спарювання (або корекція) іноді не спрацьовує, і тоді в ДНК по закінченні реплікації залишаються некомплементарні пари, тим більше, що ДНК-полімераза α позбавлена коригуючого механізму і "помиляється" частіше, ніж інші полімерази.

Репарація неспарених основ в еукаріотів. Досить часто (в E. coli з частотою 1∙10-5, в еукаріотів – ще частіше) під час реплікації ДНК відбуваються помилки спарювання. У результаті цього замість комплементарної пари нуклеотидів А-Т або G-C в дочірній ланцюг ДНК виявляються включеними нуклеотиди, не комплементарні нуклеотидам материнської нитки - мисметчі – (від англ.: mismatch – невідповідність; помилковий вибір). Такі помилки коригуються за допомогою мисметч-системи репарації. У Е. соli в процес репарації за цією схемою залучені продукти чотирьох генів: mutS, mutL, mutH і mutU. Неправильне парування (помилка реплікації) може торкнутися тільки дочірньої нитки ДНК, оскільки матрична нитка в процесі реплікації залишається незмінною. Отже, система репарації мисметчей повинна діяти на дочірньому ланцюзі та робити заміну некомплементарних основ лише в ній. Як клітина розпізнає материнський ланцюг (матрицю) і як відрізняє від неї дочірній ланцюг? У 70-х рр. минулого століття було встановлено, як клітини використовують важливу відмінність матричної структурі і дочірньої ниток. Виявилося, що незабаром після закінчення реплікації спеціальні ферменти – метилази приєднують метильні групи до аденинів у послідовностях GATC. Тому під час наступного раунду реплікації нитки ДНК виявляються поміченими: материнська нитка несе метильовані аденіни, а в дочірній їх модифікація почнеться тільки по закінченні реплікації. Поки вони залишаються неметильованими, клітини повинні встигнути виконати репарацію мисметчей.

В еукаріотів розпізнавання і видалення некомплементарного нуклеотиду відбуваються за участю спеціальних білків mut S, mut L, mut H. Кожен з білків виконує свою специфічну функцію. Процес починається з того, що до некомплементарної пари мисметча приєднується білок MutS. З ним одночасно зв'язується білок Mut L і дві молекули білка MutH. Mut Н приєднується до метильованої (за аденіном) ділянки -GATC-, розташованої поблизу некомплементарної пари. Сполучником між mut S і mut Н служить білок mut L, його приєднання завершує утворення активного ферменту. Формування комплексу mut S, mut L, mut Н на ділянці, що містить помилку, сприяє проявленню у білка mut Н ендонуклеазної активності. Ферментативний комплекс гідролізує фосфоефірний зв'язок у неметильованому ланцюзі (рис.2).

Отже, білок MutH здатний розпізнати ділянку GATC і має ендонуклеазну активність. Завдяки цим властивостям білок MutH розрізає нитку ДНК поблизу аденіну в неметилированній (тобто дочірній) нитці. Надрізи можуть бути внесені в 5' - і 3'-положенні аденіну. Мультимолекулярний комплекс, складений з цих білків, масивний і зв'язує довгий фрагмент ДНК. Цей фрагмент ДНК простягається через комплекс доти, поки дві ділянки GATC, розташовані по обидві сторони від мисметча, утримуваного білком MutS, не виявляться захопленими молекулами білка MutH. Іноді відстань між ділянками GATC може перевищувати кілька тисяч нуклеотидів. Завдяки своїй ендонуклеазній активності MutH розрізає дочірню нитку. Якщо такий надріз зроблений з 5'-сторони від аденіну, до нього приєднується ще один білок – екзонуклеаза, яка розщепить нитки ДНК в напрямку 5'→3'. Цей білок зруйнує всю дочірню нитку до місця неправильного спаровування і навіть пройде трохи далі. Первинний надріз може бути зроблений і з 3'-сторони мисметча. В цьому випадку потрібно буде інша екзонуклеаза, що рухається по ДНК в напрямку 3'→5'. Її робота буде продовжуватися доти, поки не буде усунена ділянка мисметча. Потім в обох випадках, як з 5'-3'-, так і з 3'-5'-екзонуклеазою, прогалини забудовуються ДНК-полімеразою, а кінці з'єднані за допомогою лігаз. Зрозуміло, для вивільнення кінців ниток після внесення первинних розрізів молекула ДНК має бути расплетена (потрібен білок геліказа), потрібні також джерела енергії у вигляді АТФ, а для забудови прогалин – дезоксирибонуклеозидтрифосфати. Такий процес репарації виявлений в клітинах людини, дріжджів і деяких інших організмів.

Об'єктом впізнавання ферментами репарації можуть служити і розриви в ланцюзі ДНК. Так як у вищих організмів синтез ДНК відбувається не безперервно, а окремими репліконами, то знову синтезований ланцюг ДНК має розриви, що робить можливим її впізнавання.

Отже, система репарації некомплементарних пар повинна відбуватися тільки на дочірньому ланцюзі та робити заміну некомплементарных основ лише в ній. Ферменти, що беруть участь у видаленні неправильної пари нуклеотидів, розпізнають матричний ланцюг за наявністю метильованих залишків аденіну в послідовностях -GATC-. Поки основи нуклеотидних залишків у дочірнього ланцюга неметильовані, ферменти повинні встигнути виявити помилки реплікації і усунути їх.

Рис. 2. Система репарації помилок реплікації. 1 - білок mut S "впізнає" некомплементарну пару та приєднується в цій ділянці ДНК; 2 - білки mut H взаємодіють з метильованою за аденіном послідовністю материнського ланцюга -GATC-; завершується формування ферментативного комплексу після приєднання mut L; 3 - комплекс впізнає знову синтезований ланцюг за відсутністю метильованого залишку аденіну в послідовності -GATC - і розриває її; 4 - екзонуклеаза видаляє фрагмент дочірнього ланцюга ДНК, що містить помилку; 5 - ДНК-полімераза β за принципом комплементарності забудовує прогалину; 6 - ДНК-лігаза з’єднує З'-кінець знову синтезованого фрагмента з основним ланцюгом і завершує репарацію помилки.

 

Отже, в еукаріотів розпізнавання і видалення (перший етап) некомплементарного нуклеотиду відбуваються за участю спеціальних білків mut S, mut L, mut H. Такий комплекс гідролізує фосфоефірний зв'язок у неметильованому ланцюзі. До вільних кінців ланцюга приєднується екзонуклеаза (другий етап). Відщеплюючи по одному нуклеотиду в напрямку від 3' до 5'- кінця дочірнього ланцюга, вона усуває ділянку, що містить некомплементарную пару. Прогалину забудовує ДНК-полімераза β (третій етап), з'єднання основної та знову синтезованої ділянки ланцюга каталізує ДНК-лигаза (четвертий етап). Для успішного функціонування екзонуклеази, ДНК-полімерази р і ДНК-лігази необхідна участь у репарації хелікази та SSB-білків.

 

1.2. Депуринізація (апуринізація)
ДНК кожної клітини людини втрачає за добу близько 5000 пуринових залишків внаслідок розриву N-глікозидного зв'язку між пурином і дезоксирибозою (рис. 3).

Рис. 3. Депуринізація - спонтанне видалення аденіну або гуаніну

Тоді в молекулі ДНК на місці цих основ утворюється ділянка, позбавлена азотистих основ, названа АП-сайтом (AP-site, або апуриновий сайт). Термін "АП-сайт" використовують також у тих випадках, коли з ДНК випадають пиримідинові основи та утворюються апиримідинові сайти (від англ. apurinic-apyrimidinic site). Такий тип пошкоджень усуває ДНК-інсертаза (від англ. insert - вставити), здатна приєднувати до дезоксирибози азотисту основу у відповідності з правилом комплементарності. У цьому випадку немає необхідності розрізати ланцюг ДНК, вирізати неправильний нуклеотид і репарувати розрив.

 

1.3.Дезамінування
Реакції дезамінування цитозину та перетворення його в урацил (рис. 4), аденіну - в гіпоксантин, гуаніну - в ксантин відбуваються значно рідше, ніж депуринізація (з частотою 10 реакцій на один геном за добу). Виправлення цього виду спонтанного пошкодження відбувається в п’ять етапів (рис.5).

У репарації бере участь ДНК-N-глікозилаза, яка гідролізує зв'язок між аномальною основою та дезоксирибозою (перший етап). У результаті утворюється АП-сайт, який розпізнає фермент АП-ендонуклеаза (другий етап). Як тільки в ланцюзі ДНК виникає розрив, в роботу вступає ще один фермент - АП-екзонуклеаза, який відщеплює від ланцюга дезоксирибозу, позбавлену азотистої основи (третій етап). У ланцюзі ДНК з'являється прогалина розміром в один нуклеотид. Наступний фермент ДНК-полімераза р до З'-кінця розірваного ланцюга приєднує нуклеотид за принципом комплементарності (четвертий етап). Щоб з'єднати два вільних кінця (3'-кінець вбудованого нуклеотиду і 5'-кінець основного ланцюга), потрібний ще один фермент ДНК-лігаза (п'ятий етап). Не репарується і тому є небезпечним дезамінування метильованого цитозину. Продукт його спонтанного дезамінування – тимін – є нормальною для ДНК азотистою основою, що не розпізнається ДНК-N-глікозилазою.

 

Рис. 4. Продукти спонтанного дезамінування різних основ ДНК. Всі продукти дезамінування (урацил, гіпоксантин, ксантин) нехарактерні для складу ДНК і тому легко распізнаються ферментами репарації

Рис. 5.- Репарація АП-сайтів за участю ДНК-М-глікозилази та АП-екзонуклеази

Азотисті основи, що містяться в ДНК, можуть змінюватися під впливом реакційноздатних сполук, які порушують їх нормальне парування, а також під дією ультрафіолетового випромінювання, яке може викликати утворення ковалентного зв'язку між двома сусідніми залишками тиміну в ДНК (димери тиміну). Названі зміни в черговому циклі реплікації повинні призвести до випадіння пар основ у дочірньої ДНК або до заміни одних пар іншими. Зазначені зміни дійсно супроводжують кожний цикл реплікації ДНК, проте їх частота є значно меншою, ніж повинна була бути. Це пояснюється тим, що більшість змін такого типу усувається завдяки дії механізму репарації (молекулярного відновлення) вихідної нуклеотидної послідовності ДНК.