Фотореактивація. Утворення димерів піримідинових основ



Мы поможем в написании ваших работ!


Мы поможем в написании ваших работ!



Мы поможем в написании ваших работ!


ЗНАЕТЕ ЛИ ВЫ?

Фотореактивація. Утворення димерів піримідинових основ



Якщо мікроорганізми опромінити ультрафіолетовим (УФ) світлом у дуже великій дозі, вони загинуть. Відбувається це внаслідок того, що в результаті УФ-опромінення в ДНК відбуваються хімічні зміни тиминів, розташованих поруч. Вони утворюють один з одним чотири ковалентні зв'язки, формуючи димери (рис. 6). У результаті цього порушується зчитування інформації з ДНК і її реплікація.

Рис. 6. - Димер тиміну - циклобутанове кільце (складається з чотирьох атомів карбону при взаємодії атомів сусідніх пиримідинових основ)

Під дією ультрафіолетового опромінення (УФО) подвійний зв'язок між С5 і С6 атомами карбону в складі піримідинових основ (тимину та цитозину) розривається. Атоми карбону залишаються зв'язаними одним зв'язком. Відстань між паралельними площинами основ полінуклеотидного ланцюга, в яких стався розрив, дорівнює приблизно 3,4 (ангстрем). Така відстань дозволяє валентностям між С-С атомами піримідинових основ, що звільнилися, розташованим послідовно в ланцюзі ДНК, сформувати циклобутанове кільце (рис.6). У залежності від того, які основи з'єднані в димер, їх називають димерами тиміну, цитозіну або тимін-цитозиновими димерами.

У 1949 р. було виявлено, що освітлення актиноміцетів, бактеріофага та парамецій видимим світлом відновлює їх життєздатність після УФ-опромінення в летальних дозах. Це явище було назване фотореактивацією. Тимінові димери, що виникли в результаті УФ-опромінення, під дією видимого світла руйнуються, і тиміни повертаються до своєї вихідної форми.
Фотореактивацію каталізує фермент фотоліаза, який кодується геном phr. Цей фермент активується фотонами світла і розщеплює димер на вихідні складові. Однак не всі тимінові димери можуть бути фотореактивованими; їх виправляють інші репараційні механізми Фотоліаза виявлена у прокаріотів і нижчих еукаріот. У людини фотоліаза не виявлена.

Отже, видалення піримідинових димерів відбувається під дією фотоліази (рис.7). Фермент розщеплює новоутворені зв'язки між сусідніми піримідиновими основами та відновлює нативну структуру ДНК. У фотоліазі є ділянка, яка або сама поглинає фотони (в синій частині спектру), або зв'язується з кофакторами, що адсорбують світло. Таким чином, світло активує фотоліазу, яка розпізнає димери в опроміненій ДНК, приєднується до них і розриває зв’язки, що виникли між піримідиновими кільцями зв’язку. Після цього фермент видаляється з ДНК.

 

 

 

Рис. 7. Утворення димерів тиміну при УФ опроміненні (2800 Å) та розрізання димеру при активації фотореактивуючого ферменту видимим світлом (2400 Å) [Дубінін М.П., 1986]
Пошкодження основ ДНК хімічними мутагенами

Азотисті основи в ДНК можуть піддаватися різноманітним пошкодженням: алкілування, окислення, відновлення або зв'язування основи з формамідними групами. Репарація починається з приєднання ДНК-N-глікозилази до ушкодженої основи. Існує безліч ДНК-М-глікозилаз, специфічних до різних модифікованих основ. Ферменти гідролітично розщеплюють N-гликозидний зв'язок між зміненою основою та дезоксирибозою, це призводить до утворення АП-сайту в ланцюзі ДНК (перший етап). Репарація АП-сайту може відбуватися або тільки за участю ДНК-інсертази, яка приєднує до дезоксирибози основу за правилом комплементарності, або за участю всього комплексу ферментів, що беруть участь у репарації: АП-ендонуклеази, АП-екзонуклеази, ДНК-полімерази β , ДНК-лігази.

Репарація алкілуючих ушкоджень
Приєднання до нуклеотидів алкільних або метильних груп призводить до хімічних змін нуклеотидів, отже, до генетичних пошкоджень ДНК. Такі пошкодження репаруються шляхом видалення цих груп специфічними ферментами. Слід зауважити, що в цій репаруючій системі модифікована основа не видаляється з ДНК. У подібних випадках фермент розпізнає метильовану азотисту основу в ДНК і видаляє метильну групу, перетворюючи основу в вихідну форму.
Репарація полінуклеотидлігазою Більшість факторів, наприклад, іонізуюче випромінювання, може спричинити однониткові розриви ДНК. Такі розриви усуваються прямою репарацією іншого типу – за допомогою ферменту ДНК-полінуклеотидлігаза, який здійснює пряме з'єднання розірваних кінців в молекулі ДНК.

 

Ексцизійна репарація ДНК

Існують ще більш складні процеси відновлення правильної структури ДНК, коли досить протяжні пошкоджені ділянки вирізаються з ланцюга ДНК, а потім утворені прогалини заповнюються неушкодженим матеріалом. Ці процеси були відкриті в 1964 р. У чутливих до УФ-світла мутантів E. coli після опромінення ультрафіолетом виявляли більш високий, ніж у нормі, рівень мутацій, індукованих в темряві. Ці мутації були названі uvrA (UV-repair – репарація УФ). Мутанти uvrA можуть репарувати димери тільки із споживанням світла, тобто вони мають нормальну систему фотореактивації. Тому припустили, що має бути інша система репарації, яка не вимагає світла. Ця система була названа темновою або ексциційною репарацією. Так як клітини дикого типу можуть репарировать димери в темряві, алель дикого типу називають uvrА+. Ексцизійна система репарації у E. coli коригує не тільки піримідинові димери, але й інші серйозні порушення ДНК.

Ексцизійна репарація (від англ. excision — вирізання) - видалення пошкоджених азотистих основ з ДНК і подальше відновлення нормальної структури молекули; триває за участю ферментативної системи, яка видаляє коротку однониткову послідовність дволанцюгової ДНК , що містить помилково спарені або пошкоджені основи, і заміщує їх шляхом синтезу послідовності, комплементарній нитці ДНК, що залишилася.

Ексцизійна репарація є найбільш поширеним способом репарації модифікованих основ ДНК. Цей тип репарації базується на розпізнаванні модифікованої основи різними гликозілазами, що розщеплюють N-гликозидний зв'язок цієї основи з сахарофосфатним остовом молекули ДНК. При цьому існують глікозилази, що специфічно розпізнають присутність в ДНК певних модифікованих основ (оксиметилурацила, гіпоксантину, 5-метилурацилу, 3-метиладенину, 7-метилгуанину тощо). Для багатьох глікозилаз до теперішнього часу описаний поліморфізм, пов'язаний із заміною одного з нуклеотидів в кодуючій послідовності гена. Для ряду ізоформ цих ферментів була встановлена асоціація з підвищеним ризиком виникнення онкологічних захворювань [ Chen, 2003 ].

Ексцизійна репарація (excision repair) є більш радикальним і ефективним шляхом виправлення порушень нуклеотидів, коли пошкоджена одноланцюгова ділянка вирізається з ДНК, а інший ланцюг використовується далі як матриця для нового синтезу. Відмінною особливістю ексцизійної репарації є видалення пошкодженої ділянки ДНК. Цей вид репарації не настільки специфічний щодо пошкоджень ДНК, як фотореактивація, тому що за його допомогою можуть виправлятися не тільки піримідинові димери, але й багато інших змін структури ДНК.

Ексцизійна репарація являє собою багатоетапний процес і включає наступні стадії:

1) впізнавання пошкодження в ДНК, що здійснюється специфічними ендонуклеазами, які виконують і наступну стадію;

2) надрізання одного ланцюга ДНК поблизу пошкодження — інцизія (здійснюють ендонуклеази);
3) видалення групи нуклеотидів разом з ушкодженням — ексцизія (здійснюють екзонуклеази);
4) ресинтез ДНК — заповнення прогалин, що утворилися (ДНК-полімеразна активність);
5) відновлення безперервності ланцюга, що репарується, за рахунок утворення ковалентних зв'язків сахарофосфатного остова молекули.

Найкраще механізм ексцизійної репарації вивчений на прикладі темнового видалення піримідинових димерів з ДНК E. coli, опромінених ультрафіолетом. У клітинах кишкової палички за цей процес відповідають гени uvrA-D (кодують структуру ферментів, що вирізають ділянку ланцюга ДНК з димером), а також polА (визначає структуру ДНК-полімерази I, що здійснює репаративний синтез ДНК). Особливістю такого способу ексцизійної репарації є утворення одноланцюгових надрізів по обидва боки від тиминового димера.

У тих випадках, коли виправлення самого нуклеотиду є неможливим, клітина виправляє помилку іншим, вже кардинальним шляхом – вона намагається вирізати або поодинокий невірний нуклеотид, або деяку послідовність нуклеотидів. Існує два варіанти такої репарації.

1. При ексцизійній репарації поодиноких змінених азотистих основ (Base Excision Repair –BER), що відбувається в усіх організмів, модифікована азотиста основа видаляється ферментом глікозилазою. Існує певна кількість специфічних глікозилаз, що розпізнають різноманітні модифіковані основи. Глікозилаза руйнує глікозидний зв’язок між основою та С1-атомом дезоксирибози (рис. 8). У результаті в тому місці, де видалена азотиста основа ДНК, залишається прогалина - так званий АП-сайт (апуриновий (якщо немає А або Г) або апіримідиновий (якщо немає Т або Ц), який упізнається АП-ендонуклеазою, що гідролізує фосфодіефірний зв’язок між 5′-фосфатом звільненої від основи дезоксирибози та попереднім нуклеотидом. Дал завдяки фосфодіестеразній активності ДНК-полімераза β відщеплює фосфодезоксирибозу, тому в ДНК залишається прогалина довжиною в один нуклеотид. Ця прогалина заповнюється ДНК-полімеразою β (в еукаріотів), яка приєднує нуклеотид до 3′ ОН-групи попереднього нуклеотиду ланцюга. Фосфодіефірний зв’язок приєднаного нуклеотиду з наступним нуклеотидом ланцюга відновлюється лігазою. У прокаріотів заповнення прогалини здійснюється ДНК-полімеразою І. При цьому, за рахунок своєї 5′-екзонуклеазної активності, полімераза може руйнувати певну ділянку з 5′-кінця прогалини, одночасно продовжуючи 3′-кінець.

Рис. 8. Ексцизійна репарація азотистих основ. Пошкоджена основа забарвлена червоним


2. Ексцизійна репарація нуклеотидних послідовностей
(Nucleotide Excision Repair – NER) – процес, пов’язаний із вирізанням ділянки ДНК, яка містить пошкодження (модифіковану основу, тиміновий димер тощо). У клітинах E. coli порушення розпізнається ендонуклеазою, мультисубодиничним ферментом, що кодується трьома генами – uvrA, uvrB і uvrC, що складають систему uvrABC (uvr – ultraviolet repair). Комплекс білка uvrB і двох білків uvrA впізнає пошкодження та зв’язується з ДНК у цьому місці (рис. 9). На наступному кроці відбувається АТР-залежна зміна конформації uvrB, вигин ДНК і дисоціація uvrA. До комплексу рекрутується білок uvrС. Обидва білки у складі комплексу набувають ендонуклеазної активності: uvrС робить одноланцюговий розріз у пошкодженому ланцюзі через 8 нуклеотидів у напрямку до 5′-кінця від пошкодження (ліворуч на рис.9); uvrB – другий розріз через 4 нуклеотиди з іншого боку від пошкодження. Довжина ділянки між розрізами дорівнює 12 (або 13 у випадку для тимінового димеру) нуклеотидам. Далі геліказа uvrD руйнує подвійну спіраль між двома розрізами, тобто видаляє пошкоджену ділянку.

Рис. 9. Система uvrABC ексцизійної репарації нуклеотидів у E. Coli
Прогалина, що залишилася, заповнюється ДНК-полімеразою І завдяки її 5'-3'-полімеризуючій активності, лігаза остаточно відновлює цілісність ланцюга.

Особливості моделі репарації ексцизією нуклеотидів в еукаріот.Ексцизійна репаруюча система знайдена у більшості вивчених організмів. Аналогічний, але ще більш складний механізм репарації існує в еукаріотичних клітинах. До такої репараційної системи залучено близько 17 білків, причому за руйнування подвійної спіралі відповідає геліказна частина загального фактора транскрипції TFIIH. Спочатку пошкодження ДНК розпізнаються ХРА-білком (xeroderma pigmento-sum-A) в асоціації з RPA, потім залучається фактор транскрипції TFIIH, що складається з 6 субодиниць, включаючи ХРВ і XPD, чия геліказна активність «відкриває» структуру ДНК. Після цього геліказа руйнує ділянку подвійної спіралі довжиною 24 – 32 пари основ, пошкоджена ділянка вирізається ендонуклеазами, і прогалина заповнюється ДНК-полімеразами δ/ε. Специфічні нуклеази ERCC1-XPF і XPG надрізають ДНК по обидві боки від пошкодження . Точна функція ХРС-білка, що зв'язується з одноланцюговою ДНК, до кінця не ясна, але відомо, що він потрібний для надрізання ДНК нуклеазами. ДНК-полімераза ε (епсилон) і допоміжні білки RFC та PCNA забудовують утворену прогалину. Фрагмент нової ланцюга з'єднується зі старим ланцюгом ДНК-лігазою. Таким чином забезпечується тісна координація репарації з транскрипцією: підвищена ймовірність пошкоджень та першочергова необхідність виправляти їх виникає насамперед у транскрипційно активних ділянках. Пошкодження розпізнаються або особливими білковими факторами, або РНК-полімеразою, яка робить зупинку на пошкодженому нуклеотиді.



Последнее изменение этой страницы: 2016-04-26; Нарушение авторского права страницы; Мы поможем в написании вашей работы!

infopedia.su Все материалы представленные на сайте исключительно с целью ознакомления читателями и не преследуют коммерческих целей или нарушение авторских прав. Обратная связь - 35.172.223.30 (0.02 с.)