Молекулярно-генетические методы

 Основу молекулярно-генетических методов составляет ПЦР и ее модификации. Принцип ПЦР заключается в многократном повторении (амплификации) исследуемых локусов нуклеиновых кислот термостабильной полимеразой для наработки достаточного количества ДНК и обнаружения ее методами электрофореза и гибридизации. Этот процесс достигается с помощью введения в реакционную смесь коротких молекул ДНК (праймеров), комплементарных нуклеотидным последовательностям того микроорганизма, который необходимо обнаружить. Связывание праймеров с соответствующими участками ДНК/РНК приводит к образованию локальной двухцепочечной структуры узнаваемой полимеразой, которая начинает достраивать ее в направлении 5- 3’, используя дезоксинуклеозидтрифосфаты, присутствующие в реакционной смеси. Таким образом, если один из праймеров связывается с прямой цепью, а другой с обратной, происходит наработка продукта, ограниченного с двух сторон этими праймерами. Поскольку каждый из вновь образованных продуктов - матрица для дальнейшей амплификации, происходит экспоненциальное увеличение их количества.

 Анализ полученных продуктов амплификации с помощью электрофореза заключается в разделении ампликонов под действием электрического поля в агарозном или полиакриламидном геле. После окончания электрофореза оценивается наличие и размер полученных продуктов реакции амплификации. Гибридизация заключается в нанесении на твердую фазу (микропланшет) олигонуклеотидных зондов, комплементарных внутренней структуре исследуемых ампликонов (прямая гибридизация), или нанесении на твердую фазу полученных ампликонов (обратная гибридизация).

 Добавление ампликонов или зондов, меченных либо с помощью радиоактивных меток, либо флюоресцентных, либо конъюгированных с ферментом, способным осуществлять цветовую реакцию (например, пероксидаза хрена), приводит к образованию комплексов, которые можно определять с помощью соответствующих методов. Достоинство гибридизации по сравнению с гель-электрофорезом - увеличение специфичности метода и объективизация оценки результатов эксперимента в автоматическом режиме. К недостаткам относится трудоемкость, необходимость использования специальной аппаратуры и более высокая стоимость.

 Существуют наборы ПЦР для выявления отдельных микроорганизмов (L. pneumophila, C. pneumoniae, M. pneumoniae, S. pneumoniae, M. tuberculosis, M. a vium, M. kansasii, H. capsulatum, B. dermatidis, C. immitis, A. fumigatus, P. jiroveci, T. gondii, респираторных вирусов, ВПГ, ЦМВ, ТОРС-коронавируса) и одновременного выявления нескольких возбудителей.

 Наиболее перспективна - мультиплексная ПЦР в реальном времени, позволяющая определять наличие ДНК различных возбудителей в одной пробирке в течение менее 3 ч. Принцип основан на непосредственном иммунофлюоресцентном определении амплифицированных генов по мере их генерации in vitro. Эффективность подобного подхода была доказана в ряде исследований [52]. Однако требуется осторожность в интерпретации результатов для дифференциации между колонизацией (или латентными формами) и инфекцией. Пневмококки, хламидии, микоплазмы, кандиды, пневмоцисты встречаются у индивидуумов и в отсутствие инфекции. Герпес-вирусы, токсоплазмы, пневмоцисты могут существовать в латентной стадии в тканях и не вызывать инфекцию.

 Некоторые организмы трудно или невозможно выявить другими методами и молекулярная диагностика становится единственно возможной. Диагностическая специфичность и чувствительность могут достигать 98 - 100%.

 type: dkli00064

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

 Лаборатории клинической микробиологии играют жизненно важную роль в этиологической диагностике ИНДП. Надежность результатов микробиологического исследования зависит от целого ряда условий:

 --- правильного получения адекватного материала;

 --- своевременной его доставки в лабораторию в соответствующих средах или контейнерах;

 --- преданалитической обработки образцов в соответствии с задачами исследования;

 --- чувствительности и специфичности используемых методов для выявления возбудителя и его маркеров;

 --- грамотной трактовки результатов исследования в соответствии с клиническими, радиографическими и другими лабораторными данными пациента.

9

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

 1.Ansorg R., van der Boom R., Rath P.M. Detection of Aspergillus galactamannan antigen in foods and antibiotics // Mycoses. - 1997. - Vol. 40. - P. 353 - 357.

 2.Boersma W.G., Lowenberg A., Lolloway Y. Pneumococcal capsular antigen detection and pneumococcal serology in patients with community-acquired pneumonia // Thorax. - 1991. - Vol. 46. - P. 902 - 906.

 3.Bradsher R.W., Chapman S.W., Pappas P.G. Blastomycosis // Infect. Dis. Clin. N. Am. - 2003. - Vol. 17. - P. 21 - 40.

 4.Capeding M.R.Z., Nohynek H., Ruutu P. Evaluation of a new tube latex agglutination test for detection of type-specific pneumococcal antigens in urine // J. Clin. Microbiol. - 1991. - Vol. 29. - P. 1818 - 1821.

 5.Cook D.J., Fitzgerald J.M., Guyatt G.H., Walter S. Evaluation of the protected brush catheter and bronchoalveolar lavage in the diagnosis of nosocomial pneumonia // J. Intens. Care Med. - 1991. - Vol. 6. - P. 196 - 205.

 6.Crawford S.W., Bowden R.A., Hackman R.C. Rapid detection of cytomegalovirus pulmonary infection by bronchoalveolar lavage and centrifugation culture // Ann. Intern. Med. - 1988. - Vol. 108. - P. 180 - 185.

 7.Cregan P., Yamamoto A., Lum A., e.a. Comparison of four methods for rapid detection of Pneumocystis carinii in respiratory specimens // J. Clin. Microbiol. - 1990. - Vol. 28. - P. 2432 - 2436.

 8.Duperval R., Hermans P.E., Brever N.S., et.al. Cryptococcosis, with emphasis on the significance of isolation of Cryptococcus neoformans from the respiratory tract // Chest. - 1977. - Vol. 72. - P. 13 - 19.

 9.Fishman J.A., Roth R.S., Zanzot E.М. Use of induced sputum specimens for microbiological diagnosis of infections due to organisms other than Pneumocystis carinii // J. Clin. Microbiol. - 1994. - Vol. 32. - P. 131 - 134.

 10.Freidig E.E., Smith T.F., Wilson W.R. Failuer to recover Chlamydia trachomatis from open lung biopsy tissue of adult immunosuppressed patients // Chest. - 1984. - Vol. 86. - P. 649.

 11.Gay G.D., Smith T.F., Ilstrup D.M. Comparison of processing techniques for detection of Pneumocystis carinii cystis in open lung biopsy specimens // J. Clin. Microbiol. - 1985. - Vol. 21. - P. 150 - 151.

 12.Grayston J.T. Chlamydia pneumoniae, strain TWAR // Chest. - 1989. - Vol. 95. - P. 664 - 669.

 13.Hammerman K.J., Powell K.E., Hristianson P.S., et al. Pulmonary cryptococcosis. Clinical forms and treatment // Am. Rev. Respir. Dis. - 1973. - Vol. 108. - P. 1116 - 1123.

 14.Herbrecht R., Natarajan-Ame S., Letscher-Bru V., et al. Invasiv pulmonary aspergillosis // Semin. Respir. Crir Care Med. - 2004. - Vol. 25. - P. 191 - 202.

 15.Holmberg H., Holme T., Krook A. Detection of C polysaccharide in Streptococcus pneumoniae in the sputa of pneumonia patients by an enzyme-linked immunosorbent assay // J. Clin. Microbiol. - 1985. - Vol. 22. - P. 111 - 115.

 16.Holmberg H, Krook A. Comparison of enzyme-linked immunosorbent assay with coagglutination and latex agglutination for rapid diagnosis of pneumococcal pneumonia by detecting antigen in sputa // Eur. J. Clin. Microbiol. - 1986. - Vol. 5. - P. 282 - 286.

 17.Jimenez P., Salidias F., Meneses M. Diangostic fiberoptic bronchoscopy in patients with community-acquired pneumonia. Comparison between bronchoalveolar lavage and telescoping plugged catheter cultures // Chest. - 1993. - Vol. 103. - P. 1023 - 1027.

 18.Johanson W.G., Pierce A.K., Sanford J.P., et al. Nosocomial respiratory infections with gram-negative bacilli. The significans of colonization of the respiratory tract // Ann. Intern. Med. - 1972. - Vol. 77. - P. 701 - 706.

 19.Jules - Elysee K.M., Stover D.E., Zaman M.B. Aerosolized pentamadine: effect on diagnosis and presentation of Pneumocystis carinii pneumonia // Ann. Intern. Med. - 1990. - Vol. 112. - P. 750 - 787.

 20.Kahn F.W., Jones J.M. Analysis of bronchoalveolar lavage specimens from immunocompromised patients with a protocol applicable to the microbiology laboratory // J. Clin. Microbiol. - 1988. - Vol. 26. - P. 1150 - 1155.

 21.Kim T.C., Blackman R.S., Heatwole K.M., et al. Acid-fast bacilli in sputum smears of patients with pulmonary tuberculosis. Prevalence and significance of negative smears pretreatment and positive smear post-treatment // Am. Rev. Respir. Dis. - 1984. - Vol. 129. - P. 264 - 268.

 22.Krick J.A., Remington J.S. Opportunistic invasive fungal infections in patients with leujaemia and lymphoma // Clin. Haematol. - 1976. - Vol. 5. - P. 249 - 310.

 23.Leroy O., Santre C., Beuscart C. A five-year study of severe community-acquired pneumonia with emphasis on prognosis in patients admitted to an intensive care unit // Intensive Care Med. - 1995. - Vol. 21. - P. 24 - 31.

 24.Malsh T.J., Merz W.G., Lee J.W., et al. Diagnosis of invasive fungal infections. Advances in nonculture systems // Curr. Clin. Top. Infect. Dis. - 1998. - Vol. 18. - P. 101 - 153.

 25.Mandell L.A., Bartlett J.G., Dowell S.F., e.a. Update of Practice Guidelines for the Management of Community-Acquired Pneumonia in Immunocompetent Adults // Clin. Infect. Dis. - 2003. - Vol. 37. - P. 1405 - 1433.

 26.Masur H., Rosen P.P., Armstrong D. Pulmonary disease caused by Candida species // Am. J. Med. - 1977. - Vol. 63. - P. 914 - 925.

 27.Mathers G. Bacteriology of the urine in lobar pneumonia // J. Infect. Dis. - 1916. - Vol. 19. - P. 416 - 418.

 28.Mayer J. Laboratory diagnosis of nosocomial pneumonia // Semin. Respir, Infect. - 2000. - Vol. 15. - P. 119 - 131.

 29.Meduri G.U., Chastre J. The standardization of bronchoscopic techniques for ventilator-associated pneumonia // Chest. - 1992. - Vol. 102. - P. 557 - 564.

 30.Metersky M.L., Bratzler D.W., Houck P.M. Predicting bacteremia in patients with community-acquired pneumonia // Am. J. Respir. Crit care Med. - 2004. - Vol. 169. - P. 342 - 347.

 31.Murdoch D.R. Diagnosis of Legionella infection // Clin. Infect. Dis. - 2003. - Vol. 36. - P. 64 - 69.

 32.Musher D.M., Monotoya R., Wanahita A. Diagnostic value of microscopic examination of Gram-stained sputum and sputum cultures in patients with bacteremic pneumococcal pneumonia // Clin. Infect. Dis. - 2004. - Vol. 39. - P. 165 - 169.

 33.Noone P., Rogers B.T. Pneumonia caused by coliforms and Pseudomonas aeruginosa // J. Clin. Pathol. - 1976. - Vol. 29. - P. 652 - 656.

 34.Ortqvist A., Kalin M., Lejdeborn L., Lundberg B. Diagnostic fiberoptic bronchoscopy and protected brush culture in patients with community-acquired pneumonia // Chest. - 1990. - Vol. 97. - P. 576 - 582.

 35.Paya C.V., Roberts D.G., Cockerill F.R. Laboratory diagnosis of disseminated histoplasmosis. Clinical importance of the lysis-centrifugation blood culture technique // Mayo Clin. Proc. - 1987. - Vol. 62. - P.480 - 485.

 36.Pisani R.J., Wright A.J. Clinical utility of bronchoalveolar lavage in immunocompromised hosts // Mayo Clin. Proc. - 1992. - Vol. 67. - P. 221 - 227.

 37.Plouffe J.F., McNally C., File T.M.Jr. Value of noninvasive studies in community-acquired pneumonia // Infect. Dis. Clin. North Am. - 1998. - Vol. 12. - P. 689 - 699.

 38.Rein M.F., Gwaltney J.M., O’Brien W.M., et al. Accuracy of Gram’s stain in identifying pneumococci in sputum // JAMA. - 1978. - Vol. 239. - P. 2671 - 2673.

 39.Reingold A.L., Thomason B.M., Brake B.J., e.a. Legionella pneumonia in the United States: the distribution of serogroups an species causing human illness // J. Infect. Dis. - 1984. - Vol. 149. - P. 819.

 40.Roberts G.D., Goodman N.L., Heifets L., et al. Evaluation of the BACTEC radiometric method for recovery of mycobacteria and drug susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis from acid-fast smear-positive specimens // J. Clin. Microbiol. - 1983. - Vol. 18. - P. 689 - 696.

 41.Strimlan C.V., Dines D.E., Rodgers-Sulivan R.F., et al. Respiratoty tract Aspergillus. Clinical significans // Mim. Med. - 1980. - Vol. 63. - P. 25-29.

 42.Thornley P.E., Aitken J., Drennan C.J., et al. Branchamella catarrhalis infection of the lower respiratory tract: Reliable diagnosis by sputum examination // Br. Mrd. J. - 1982. - Vol. 285. - P. 1537 - 1538.

 43.Thorpe J.E., Baughman R.P., Frame P.T. Bronchoalveolar lavage for diagnosing acute bacterial pneumonia // J. Infect. Dis. - 1987. - Vol. 155. - P. 855-861.

 44.Thorsteinsson S., Musher D.M., Fagan T. The diagnostic value of sputum culture in acute pneumonia // JAMA. - 1975. - Vol. 233. - P. 894 - 895.

 45.Tillotson J.R., Finland M. Bacterial colonization and clinical superinfection of the respiratory tract complicating antibiotic treatment of pneumonia // J. Infect. Dis. - 1969. - Vol.119. - P. 597 - 624.

 46.Verghese A., Berk S.L. Bacterial pneumonia in the elderly // Medicine. - 1983. - Vol. 62. - P. 271 - 285.

 47.Verhelst R., Kaijalainen T., De Baere T., et al. Comparison of five techniques for identification of optochin-resistant pneumococcus-like isolates // J. Clin. Microbiol. - 2003. - Vol. 41. - P. 3521 - 3525.

 48.Verkooyen R.P., Willemse D., Hiep-van Casteren, et al. Evaluation of PCR, culture and serology for diagnosis of Chlamydia pneumoniae respiratory infections // J. Clin. Microbiol. - 1998. - Vol. 36. - P. 2301 - 2307.

 49.Welti M., Jaton K., Altwegg M., et al. Development of a multiplex real-time quantitative PCR assay to detect Chlamydia pneumoniae, Legionella pneumophila and Mycoplasma pneumoniae in respiratory tract secretions // Diagn. Micribiol. Infect. Dis. - 2003. - Vol. 45. - P. 85 - 95.

 50.Wheat J., Wheat H., Connoly P., et al. Cross-reactivity in Histoplasma capsulatum variety capsulatum antigen assay of urine samples from patients with endemic mycoses // Clin. Infect. Dis. - 1997. - Vol. 24. - P. 1169 - 1171.

 51.Wheat L.J., Kauffman C.A. Histoplasmosis // Infect. Dis. Clin. N. Am. - 2003. - Vol. 17. - P. 1 - 19.

 52.Xavier R., Henn L., Costa R. Bronchoalveolar lavage in pulmonary tuberculosis // Chest. - 1990. - Vol. 98. - P. 975.

 

document:

 $pr:

 version: 01-2007.1

 codepage: windows-1251

 type: klinrek

 id: kli5327367

 : 05.3. МЕТОДЫ ВИЗУАЛИЗАЦИИ

 meta:

 author:

 fio[ru]: И.Е. Тюрин

 codes:

 next:

 type: dklinrek

 code: II.I

 type: dkli00023

ВВЕДЕНИЕ

 Методы лучевой диагностики (син.: методы визуализации, методы диагностической радиологии) играют ключевую роль в выявлении, определении характера и распространенности патологического процесса органов дыхания, а также в оценке эффективности проводимого лечения.

 В течение последних 20 лет в торакальной радиологии произошли кардинальные изменения. В начале 70-х годов XX века появились первые образцы рентгеновских компьютерных томографов, и уже в середине десятилетия стало возможным аксиальное сканирование различных анатомических областей тела, в том числе и органов грудной полости на задержанном дыхании. В 80-х годах разработана методика высокоразрешающей компьютерной томографии для изучения патологии легких, началось клиническое применение магнитно-резонансной томографии и ультразвуковых методов исследования, которые получили широкое распространение в последнем десятилетии прошлого века, в том числе и при исследовании органов дыхания. В этот же период времени произошло становление спиральной технологии сканирования в компьютерной томографии. На ее основе возникли первые клинические образцы программ для трехмерных преобразований и методики компьютерно-томографической ангиографии. Начало нового века характеризуется созданием КТ-аппаратов с многорядными детекторами и интенсивным внедрением в клиническую практику позитронно-эмиссионной томографии как в виде самостоятельного исследования, так и в сочетании с компьютерной томографией.

 На фоне революционных преобразований в области современных томографических технологий продолжается интенсивное развитие традиционного рентгеновского исследования. От рутинных рентгенотомографических методик эта область торакальной радиологии перешла к цифровой радиологии, основу которой составляют современные цифровые детекторы рентгеновского излучения.

 В результате произошедших технологических изменений, традиционное рентгено-радиологическое исследование больных с заболеваниями органов дыхания переросло торакальную радиологию, использующую все современные методы лучевой диагностики:

 ---традиционное рентгенологическое исследование;

 ---рентгеновская компьютерная томография (КТ);

 ---магнитно-резонансная томография (МРТ);

 ---ультразвуковое исследование (УЗИ);

 ---радионуклидные исследования;

 ---позитронно-эмиссионная томография (ПЭТ), в том числе в сочетании с КТ (ПЭТ/КТ);

 ---интервенционные диагностические и лечебные процедуры под лучевым наведением (рентгеноскопия, УЗИ, КТ).

 type: dkli00091