Диагностика аэробных актиномицетов

 Аэробные патогенные актиномицеты включают роды Nocardia, Streptomyces, Actinomadura и Rhodococcus, Micromonospora, Micropolyspora, Thermoactinomyces и Saccharomonospora. Они вызывают пневмониты (альвеолиты) и хорошо растут

 (в течение 3 - 7 дней) на простых бактериальных и грибковых средах при 50 ⁰;С во влажной атмосфере. Однако у рода Nocardia для роста колоний может потребоваться 3 нед инкубации. Идентификацию актиномицет проводят по морфологическим признакам колоний, микроскопическому строению микроорганизмов, способности гидролизовать различные субстраты, взаимодействию чистых культур с антительными диагностикумами в серологических реакциях.

ДИАГНОСТИКА ГРИБОВ

 Лабораторную диагностику пневмомикозов проводят культуральным, гистологическим и серологическими методами. Для посева используют картофельные среды, сабуродекстрозный агар, агар на сердечно-мозговой вытяжке, также селективные среды, содержащие хлорамфеникол и гентамицин, иногда с добавлением циклогексимида, подавляющего рост быстрорастущей плесени и ингибирующего C. neoformans, Aspergillus fumigatus и некоторые виды Candida. В отличие от бактерий, которые культивируют при 35 ⁰;С, посевы грибов инкубируют при 30 ⁰;С.

 Грибы рода Candida часто обнаруживают в БАС, но они редко бывают истинными возбудителями ИНДП. При исследовании аутопсийной ткани легких гистологическое подтверждение кандидоза было выявлено лишь у 2% онкологических больных и у 0,5% пациентов без неопластических процессов [40]. Определение кандидозного антигена непосредственно в сыворотке крови или клинических образцах мало помогает в диагностике локального или диссеминированного кандидоза, поскольку чувствительный метод ИФА выявляет присутствие антигенов и антител у здоровых и у 50 - 75% больных при диссеминированном кандидозе [41].

 Инвазивный легочный аспергиллез (ИЛА) встречается чаще, чем легочный кандидоз, в 90% наблюдений выделение аспергилл из мокроты и БС связано с колонизацией НДП [42]. В то же время, при подтвержденном ИЛА лишь у 10% больных из мокроты были выделены Aspergillus spp. Для правильной интерпретации результатов культуральной диагностики необходимо производить посевы двух образцов, полученных при транстрахеальной легочной биопсии и методом ЗЩ [43]. Для ранней диагностики ИЛА может быть полезным обнаружение аспергиллезного антигена в сыворотке крови методом ИФА, чувствительность которого варьирует в пределах 60 - 100% в разных группах больных [33].

 Выделение C. neoformans  из респираторного тракта следует трактовать с осторожностью, так как в половине наблюдений у пациентов отсутствуют признаки поражения паренхимы легких, рентгенологические изменения и другие симптомы заболевания, это свидетельствует лишь о колонизации грибами [44]. Для подтверждения диагноза криптококкоза помогает обнаружение криптококкового антигена в сыворотке крови и ликворе. Антиген можно определять также в плевральном выпоте и БАС [32].

 Неопределенность в оценке положительных и отрицательных результатов посевов при диагностике оппортунистических грибковых инфекций возрастает у больных с иммунодефицитами. Существует два наиболее достоверных критерия прижизненной диагностики таких инфекций:

 ---обнаружение грибов в ткани легких при культуральном или гистологическом исследовании;

 ---выделение культуры при посеве ликвора или других стерильных жидкостей тела, исключая кровь и мочу, которые могут контаминироваться, в том числе при заборе материала [45].

 В отличие от оппортунистических возбудителей пневмомикозов, выделение патогенных диморфных грибов Blastomyces dermatitidis, Coccidioides immitis, Histoplasma capsulatum, Paracoccidioides brasiliensis  и   Sporothrix schenckii из респираторных образцов, ткани легких и биоматериалов других локализаций имеет несомненную клиническую значимость. Эти грибы существуют в мицелярной и дрожжевой (или в виде сферул) формах. В среднем, их рост на средах появляется через 14 дней (грибов рода Candida  -  через 1 - 3 дня, Aspergillus spp. - через 4 -

 7 дней). В рутинной практике посевы инкубируют до 4 нед у пациентов при серологически подтвержденной грибковой инфекции или у больных, получавших антигрибковую терапию при неустановленной этиологии инфекционного процесса. Присутствие орофарингеальной микрофлоры в респираторных образцах не препятствует интерпретации результатов посевов на диморфные грибы. Посевы осуществляют при отрицательных результатах прямой микроскопии окрашенных препаратов, в том числе специальными методами, где можно легко идентифицировать соответствующий возбудитель по характерной морфологии. При диссеминированной грибковой инфекции исследуют материалы из других анатомических областей. Например, при генерализованном гистоплазмозе прямая микроскопия окрашенных мазков костного мозга помогает быстро поставить диагноз у 50% больных, положительный посев обнаруживается в 84% наблюдений [46]. Дополнительный диагностический тест - обнаружение полисахаридного антигена H. capsulatum в моче методом ИФА у 90% больных, однако этот тест может быть положительным и у пациентов с диссеминированной инфекцией, вызванной P. brasiliensis, В. dermatidis, Penicillium marneffei [47].

ДИАГНОСТИКА ХЛАМИДИЙ

 У детей хламидийную пневмонию, вызванную C hlamydia trachomatis, можно диагностировать методом РИФ, культуральным и серологическими методами. Для посева обычно используют гетероплоидные мышиные клетки МакКой, обработанные циклогексимидом, которые инкубируют 40 - 72 ч, после чего исследуют наличие внутриплазматических включений хламидий при световой микроскопии после окрашивания иодином гликогена, продуцируемого хламидиями в инфицированных клетках. Более быстрый и чувствительный метод - РИФ при окраске культуры клеток моноклональными антителами.

 C. psittaci не продуцирует гликоген и ее внутриплазматические включения выявляют при окраске по Гимзе обычно после 5 - 10 дней инкубации. Поскольку клеточные культуры C. psittaci высоко инфекционные, метод культивирования используется редко, и диагноз пситтакоза устанавливают серологическими методами.

 C. pneumoniae  можно обнаружить при заражении респираторными образцами монослоя культуры клеток HeLa-229. После инкубации в течение 3 - 5 дней готовят окрашенные специфическими моноклональными антителами препараты и изучают методом РИФ.

 Диагноз хламидийной пневмонии ставят серологическими методами при определении антител. Однако у больных с иммунодефицитами, неспособными синтезировать в достаточном количестве антитела, может потребоваться культуральное исследование или использование молекулярно-генетических методов. Из трех видов хламидий C. trachomatis - редкий возбудитель ВП у больных с иммунодефицитами.

 Определение чувствительности хламидий к антибиотикам не имеет существенного значения, так как различия между штаммами и появление новой резистентности весьма редки, сами методы определения не стандартизированы и используются в основном с научной целью.

ДИАГНОСТИКА МИКОПЛАЗМ

 Среды для культивирования микоплазм содержат свежий дрожжевой экстракт, пептон, сыворотку животных и готовятся как двухфазная среда с агаровой основой, залитой бульоном, содержащим индикатор рН для контроля ферментации глюкозы, бензилпенициллин и ацетат таллия для подавления роста бактерий. Другие добавки включают амфотерицин В и полимиксин. В процессе инкубации посевов наблюдают появление помутнения среды в течение 4 - 6 дней, после чего производят первый высев на селективный агар, затем повторный высев на 8 - 12-й день. Рост типичных колоний обычно виден в конце 2-й недели инкубации, при отсутствии роста двухфазную среду инкубируют до 30 дней, после истечения этого периода выдают отрицательный результат. Разрешающая способность культурального метода 10⁵ КОЕ/мл, при прямом определении антигена в респираторном секрете методом ИФА - 10⁴ КОЕ/мл. Из-за медленного роста организмов и низкой чувствительности культурального метода (60%) для диагноза инфекции M. pneumoniae чаще используют определение специфических антител или ДНК-амплификационный тест.

 Чувствительность микоплазм к антимикробным препаратам определяют только в научных целях и при изучении новых препаратов. Как и хламидии они предсказуемо чувствительны к тетрациклинам, макролидам, кетолидам и фторхинолонам.

ДИАГНОСТИКА ВИРУСОВ

 Для заражения вирусами используют разные культуры клеток, возникновение инфекции определяют по цитопатическому эффекту (ЦПЭ) или появлению гемагглютинирующих антигенов. Дополнительные тесты (гемадсорбции, ингибиции гемагглютинации, нейтрализации и иммунофлюоресценции) используют для дифференциации вирусов гриппа и парагриппа. Культуральный метод при изучении респираторных образцов более чувствительный, чем определение антигенов, и занимает в среднем 3 - 4 дня для обнаружения ЦПЭ при вирусе гриппа А и 8 -

 9 дней при ЦМВ.

 Выделение вирусов гриппа, парагриппа, РСВ и риновирусов из респираторных образцов и ткани легкого имеет одинаково важное клиническое значение, в отличие от аденовирусов, вирусов простого герпеса (ВПГ) и ЦМВ, обнаружение которых в респираторных образцах не столь существенно, как в ткани легкого.

 

 type: dkli00089

СЕРОДИАГНОСТИКА

 Серодиагностика основана на выявлении специфических антител (АТ) разных классов иммуноглобулинов (IgM, IgA, IgG) в сыворотке крови у инфицированных пациентов и определении их титров при однократном исследовании или в динамике заболевания (в парных сыворотках, взятых с интервалом 10 - 14 дней) с помощью антигенных диагностикумов в различных серологических реакциях in vitro. Обычно используются реакции преципитации, агглютинации, ВИЭФ, ИФА, непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ), РСК. Эти методы имеют основное значение при подтверждении диагноза и проведении эпидемиологических исследований.

 Известны коммерческие наборы на основе ИФА и РНИФ для определения IgM АТ и IgG АТ к широкому кругу респираторных патогенов: Legionella spp., Francisella tularensis, Yersinia pestis, M. pneumoniae, C. pneumoniae, C. psittaci, Coxiella burnetii, T oxoplasma gondii, Trichinella spiralis, Strongiloides stercoralis, вирусов гриппа, парагриппа, РСВ, аденовирусов, ТОРС-коронавирусов, ВПГ, ЦМВ, вирусов краснухи и оспы, Эпштейна - Барр.

 Для диагностики инфекции, вызванной C. pneumoniae, обычно используется метод микроиммунофлюоресценция (МИФ). Результат считается положительным при четырехкратном увеличении титра АТ в парных сыворотках или при однократном определении титра IgM≥1:16 или IgG≥1:512 [49]. Аналогичные критерии применяются для C. psittaci. Чувствительность МИФ составляет 39 - 100%, специфичность - 94 - 100%, что превышает эти показатели в РСК и ИФА, применение которых при серодиагностике ИНДП хламидийной этиологии считается нецелесообразным [50]. При неонатальной пневмонии, вызванной C. trachomatis, титр видоспецифических IgM АТ 1:32 - диагностический и коррелирует с результатами культуральной диагностики. В то же время определение IgG малоинформативно из-за циркуляции у детей до 12 мес материнских АТ.

 Ввиду низкой чувствительности культурального метода, серологические тесты составляют основу диагностики микоплазменной инфекции. Холодовые агглютинины (ХА), выявляемые в реакции агглютинации с резус-отрицательными эритроцитами 0(I) группы крови при 4 ⁰;С, присутствуют приблизительно у 50% больных пневмонией, обусловленной M. pneumoniae. Их уровень приходит в норму через 6 нед после острой инфекции. Однако ХА могут образовываться при целом ряде вирусных инфекций, лимфомах, аутоиммунных нарушениях, что снижает их диагностическую ценность. Комплементсвязывающие АТ выявляют в РСК у 85% пациентов, что согласуется с результатами культурального метода. При этом важно четырехкратное нарастание титров АТ, либо титр ≥1:80 при однократном исследовании сыворотки. В последние годы получил развитие метод ИФА для выявления специфических микоплазменных IgM АТ и IgА АТ; его чувствительность и специфичность выше, чем РСК [50]. IgM АТ обнаруживают на 1-й неделе заболевания и достигают пика на 3-й неделе, у взрослых они продуцируются нерегулярно, поэтому отрицательный результат не исключает наличие инфекции. IgА АТ более постоянны, их продукция не зависит от возраста пациентов.

 Серодиагностика грибковых инфекций не всегда информативна. Определение АТ к C. albicans не позволяет провести дифференциальную диагностику локализованного и диссеминированного кандидоза, так как эти АТ присутствуют и у больных и у здоровых пациентов и только в 50 - 75% наблюдений встречаются при диссеминированном кандидозе [40].

 РСК для выявления АТ к B. dermatidis характеризуется низкой чувствительностью и специфичностью (25%), титр АТ может повышаться при инфекциях, вызванных C. immitis и H istoplasma capsulatum. Иммунодиффузионный тест для выявления АТ к B. dermatitidis более чувствительный и специфичный (40 - 70%), чем РСК. Однако и отрицательный результат не исключает диагноз бластомикоза.

 При серодиагностике криптококкоза используют реакцию преципитации для определения IgM АТ, которые обнаруживают на 2 - 3-й неделе заболевания у 75% больных, затем постепенно исчезают [42]. Комплементсвязывающие IgG АТ появляются позднее, их титр 1:32 и выше предполагает возможность диссеминированной инфекции.

 При легочном гистоплазмозе у 90% больных определяются АТ к H. capsulatum в РСК и методом иммунодиффузии, при диссеминированном процессе они встречаются в 80% наблюдений [51]. Перекрестные реакции наблюдаются при бластомикозах, коккцидиоидомикозе и паракоккцидиоидомикозе.

 type: dkli00090