III. Физиология микроорганизмов

Метаболизм

Физиология микроорганизмов изучает жизнедеятельность микробных клеток, процессы их питания, дыхания, роста, размножения, закономерности взаимодействия с окружающей средой.

Метаболизм – это совокупность биохимических процессов, направленных на получение энергии и воспроизведение клеточного материала. Он складывается из двух взаимосвязанных процессов: катаболизма и анаболизма. Катаболизм (энергетический метаболизм) – это процесс расщепления крупных молекул до более простых, в результате которого выделяется энергия, накапливающаяся в форме АТФ.

Анаболизм (конструктивный метаболизм) – обеспечивает синтез макромолекул, из которых строится клетка. При этом используется энергия, полученная в процессе катаболизма. Для метаболизма бактерий характерны высокая скорость процесса и быстрая адаптация к меняющимся условиям окружающей среды.

 

Источники углерода и типы питания

Различные органические и неорганические вещества поступают в бактериальную клетку в процессе питания. Специальных органов питания у бактерий нет. Вещества проникают через всю поверхность клетки, в виде мелких молекул. Такой способ питания называется голофитным. Необходимым условием для прохождения питательных веществ в клетку является их растворимость в воде и малая величина (т.е. белки должны быть гидролизованы до аминокислот, углеводы – до ди- или моносахаридов и т. д.).

Типы питания. Широкому распространению бактерий способствует разнообразные типы питания. Микробы нуждаются в углероде, кислороде, азоте, водороде, сере, фосфоре и других элементах (органогенах).

По источникам углерода бактерии делятся на:

1) аутотрофы (aytos – сам, trophe – пища), которые используют для построения своих клеток диоксид углерода (CO₂) и другие неорганические соединения и не нуждаются в сложных органических соединениях (белках, углеводах). Они способны синтезировать все необходимые соединения из простых веществ. Аутотрофами являются нитрифицирующие бактерии, которые находятся в почве, серобактерии, обитающие в воде, железобактерии, живущие в воде с закисным железом;

2) гетеротрофы (heteros – другой), которые питаются за счет готовых органических соединений.

Гетеротрофы подразделяются на сапрофиты, которые используют органические остатки отмерших организмов и паразиты – нуждаются в белках живых тканей. Выделяют облигатных и факультативных паразитов. Облигатные паразиты способны существовать только внутри клетки – это риккетсии, хламидии, вирусы. Факультативные паразиты могут менять тип питания и размножаться на питательных средах.

Источники энергии и доноры электронов

В зависимости от окисляемого субстрата, называемого донором электронов или водорода микробы подразделяют на 2 группы:

1) литотрофы – используют в качестве доноров электронов неорганические соединения (от греческого lithos – камень);

2) органотрофы используют в качестве доноров органические соединения.

По источнику энергии среди бактерий различают: фототрофы – используют энергию света; хемотрофы – нуждаются в химических источниках энергии.

Большинство микробов – хемоорганотрофы – они используют энергию органических соединений.

 

Факторы роста

Факторы роста – вещества, необходимые для роста и размножения микробов: витамины, аминокислоты, пуриновые и пиримидиновые основания. Некоторые микроорганизмы синтезируют факторы роста из промежуточных продуктов обмена (кишечная палочка). Для других требуется добавлять факторы роста в среду. По отношению к факторам роста различают: а) ауксотрофы – нуждаются в одном или нескольких факторах роста; б) прототрофы – могут сами синтезировать факторы роста из глюкозы и солей аммония.

 

Транспорт питательных веществ и механизм питания

 

Поступление веществ в бактериальную клетку зависит от величины и растворимости молекул в липидах или воде, рН среды, концентрации веществ, различных факторов проницаемости мембран.

Клеточная стенка пропускает небольшие молекулы и ионы, задерживая макромолекулы массой более 600 Да. Основным регулятором поступления веществ в клетку является ЦПМ.

Выделяют 4 механизма проникновения веществ в клетку: 1) простая диффузия по градиенту концентрации; 2) облегченная диффузия по градиенту концентрации и с участием ферментов; 3) активный транспорт против градиента концентрации с затратой энергии и с участием ферментов-пермеаз; 4) транслокация химических групп (перенос измененных молекул).

При простой диффузии перемещение веществ происходит вследствие разницы их концентрации по обе стороны ЦПМ. Вещества проходят через липидную часть ЦПМ (органические молекулы, лекарственные препараты) и реже по заполненным водой каналам в ЦПМ. Пассивная диффузия идет без затраты энергии. Облегченная диффузия происходит также в результате разницы концентрации веществ по обе стороны ЦПМ. Но этот процесс идет с помощью белков-переносчиков пермеаз, которые синтезируются в ЦПМ. Облегченная диффузия протекает без затраты энергии, вещества перемещаются от более высокой концентрации к более низкой.

Активный транспорт происходит с помощью пермеаз и направлен на перенос веществ от меньшей концентрации в сторону большей. Поэтому этот процесс сопровождается затратой метаболической энергии АТФ, которая образуется в результате окислительно-восстановительных реакций в клетке.

Перенос (транслокация) групп сходен с активным транспортом, но отличается тем, что переносимая молекула видоизменяется в процессе переноса, например фосфорилируется. Выход веществ из клетки идет за счет диффузии и при участии транспортных систем.

Ферменты бактерий

 

Ферменты – биологические катализаторы. Они имеют белковую природу, сравнительно высокий молекулярный вес, высокоспецифичны, быстро действуют, термолабильны, способны сохранять свою активность и после гибели клеток.

Ферменты классифицируются на:

1) экзоферменты, катализирующие процессы расщепления сложных веществ вне клетки;

2) эндоферменты – катализируют метаболизм, проходящий внутри клетки.

По объекту действия они подразделяются:

а) ферменты белкового синтеза – связаны с рибосомами,

б) ферменты энергетического обмена и транспорта питательных веществ, располагаются в ЦПМ и мезосомах,

в) ферменты метаболизма белка,

г) ферменты, расщепляющие углеводы.

Известно более 2000 ферментов, которые объединены в 6 классов:

1) оксидоредуктазы – окислительно-восстановительные ферменты (к ним относят дегидрогеназы, оксидазы);

2) трансферазы – переносят отдельные радикалы и атомы от одних соединений к другим;

3) гидролазы – ускоряют реакции гидролиза, т.е. расщепление веществ на более простые с присоединением молекул воды (эстеразы, фосфатазы, глюкозидазы);

4) лиазы – разрывают связи между атомами углерода негидролитическим путем (карбоксилазы);

5) изомеразы – превращают органические соединения в их изомеры (фосфогексоизомераза).

6) лигазы – ускоряют синтез сложных соединений из более простых (аспарагинсинтетаза).

Кроме этого различают: а) конститутивные ферменты, которые синтезируются клеткой постоянно (лиазы, оксидазы); б) индуктивно-адаптивные – синтезируются только в присутствии субстрата (пенициллиназа, щелочная фосфатаза).

У патогенных микробов есть еще и ферменты агрессии, которые способствуют проникновению, распространению и паразитированию микроорганизмов в макроорганизме (гиалуронидаза, коллагеназа, нейраминидаза, коагулаза, ДНКаза).

Значение ферментов: 1) катализируют процессы дыхания, питания, размножения; 2) используются в диагностике при определении вида возбудителя по биохимическим свойствам. С этой целью применяют среды «пестрого ряда», на которых изучают способность ферментов микробов разлагать углеводы, белки до конечных продуктов обмена. Каждый вид микроба обладает определенным набором ферментов, что обусловлено генотипом. Наибольшая активность у непатогенных микробов. У патогенных микробов биохимическая активность ниже. Ферменты микробов используют в генной инженерии (рестриктазы, лигазы) для получения биологически активных соединений, для получения уксусной, молочной, лимонной и других кислот, молочнокислых продуктов, в виноделии и других отраслях. Их добавляют в качестве биодобавок в стиральные порошки для уничтожения загрязнений белковой природы.

Дыхание микроорганизмов

Дыхание микроорганизмов – сопряженный окислительно-восстановительный процесс, при котором происходит перенос электронов и протонов от окисляемого вещества до восстанавливаемого, в результате образуется АТФ – универсальный аккумулятор химической энергии.

Все физиологические процессы – питание, рост, размножение, образование спор, капсул, выработка токсинов – осуществляются при постоянном притоке энергии. Микробы добывают энергию за счет окисления различных химических соединений: углеводов (чаще глюкозы), спиртов, органических кислот, жиров. Основную роль в дыхании большинства микроорганизмов играет цикл трикарбоновых кислот, где органические вещества как источник энергии окисляются до углекислого газа и воды, а отнятый от них пиридиновыми и флавиновыми ферментами электрон передается по дыхательной цепи активированному кислороду. Освободившаяся в результате этих процессов энергия закрепляется в АТФ или других органических фосфатах. У микроорганизмов, кроме цикла трикарбоновых кислот, может проходить цикл дикарбоновых кислот, пентозофосфатный шунт.

По типу дыхания все микроорганизмы разделяются на:

1) облигатные (строгие) аэробы,

2) облигатные анаэробы,

3) факультативные (необязательные) анаэробы,

4) микроаэрофилы.

1. Строгие аэробы (Pseudomonas aeruginosa, Bordetella pertussis) не могут жить и размножаться в отсутствие молекулярного кислорода, так как они его используют в качестве акцептора электронов. Молекулы АТФ образуются ими при окислительном фосфорилировании с участием оксидаз и флавинзависимых дегидрогеназ с дальнейшим включением в цикл трикарбоновых кислот. При этом, если конечным акцептором электронов является молекулярный кислород, выделяется значительное количество энергии.

2. Облигатные анаэробы (Сlostridium tetani, Сlostridium botulinum, Сlostridium perfringens, бактероиды) способны жить и размножаться только в отсутствии свободного кислорода воздуха. Они могут образовывать АТФ в результате окисления углеводов, белков, липидов путем субстратного фосфорилирования до пирувата (пировиноградной кислоты). При этом выделяется небольшое количество энергии. Акцептором водорода или электронов у анаэробов может быть сульфат. Если донорами и акцепторами водорода являются органические соединения, то такой процесс называется брожением. По конечному продукту расщепления углеводов различают спиртовое, молочнокислое, уксуснокислое, муравьинокислое, маслянокислое и пропионовокислое брожение. Наличие свободного кислорода для строгих анаэробов является губительным, так как у них нет ферментов (каталаз), способных расщеплять Н₂О₂; понижен окислительно-восстановительный (редокс) потенциал; отсутствуют цитохромы.

3. Факультативные анаэробы могут расти и размножаться как в присутствии кислорода, так и без него (стафилококки, кишечная палочка). Они образуют АТФ при окислительном и субстратном фосфорилировании. Факультативные анаэробы могут осуществлять анаэробное дыхание, которое называется нитратным. Нитрат, являющийся акцептором водорода, восстанавливается до молекулярного азота и аммиака. Среди факультативных анаэробов различают аэротолерантные бактерии, которые растут при наличии молекулярного кислорода, но не используют его.

4. Микроаэрофилы растут при сниженном парциальном давлении кислорода. Различают микроаэрофильные аэробы (например, гонококки), которые лучше культивируются при уменьшенном содержании О₂ (около 5%), и микроаэрофильные анаэробы, которые способны расти в анаэробных и микроаэрофильных условиях, но не культивируются в обычной воздушной среде или в СО₂.

Выделяют также капнофильные микроорганизмы. Они представляют собой бактерии, растущие в присутствии повышенных концентраций углекислого газа (3-5%). К ним относятся бактероиды, фузобактерии, гемофильные бактерии и др.

Методы культивирования строгих анаэробов:

1) Посев уколом в высокий столбик сахарного агара, который сверху заливается слоем вазелинового масла.

2) Посев на среду Китта-Тароцци (МПБ, глюкоза, кусочки печени или мяса в качестве редуцирующих веществ, сверху среда залита слоем вазелинового масла).

3) Удаление воздуха из среды механическим путем. Используют анаэростаты, из которых выкачивается воздух.

4) Замена воздуха другим индифферентным газом, например азотом, аргоном, водородом.

5) Механическая защита от кислорода воздуха (метод Виньяль-Вейона). Берут стеклянную трубку, один конец которой вытягивают в капилляр, расплавляют агар, в него засевают культуру и затем насасывают агар в стерилизованную трубку, затем капилляр запаивают и трубку помещают в термостат. В среде вырастают колонии, которые можно извлечь, распилив трубку.

6) Химическое поглощение кислорода воздуха, например щелочным раствором пирогаллола.

7) Биологический метод – комбинированный посев культур анаэробов и аэробов. Посев производят на чашку с толстым слоем кровяного агара с глюкозой, разделенную пополам небольшой дорожкой, вырезанной посередине чашки прокаленным скальпелем. На одной половине чашки делают посев культуры аэробов, а на другой – анаэробов. Края чашки смазывают парафином для герметизации и помещают в термостат. Сначала происходит рост аэробов, когда они исчерпывают из чашки кислород, начинается рост анаэробов.

Рост и размножение бактерий

Рост – увеличение размеров отдельной особи и упорядоченное воспроизведение всех химических компонентов и структур.

Размножение – процесс воспроизведения себе подобных особей, обеспечивающий продолжение существования вида.

Бактерии размножаются путем бинарного деления пополам, реже путем почкования. Актиномицеты размножаются путем фрагментации нитевидных клеток, могут размножаться спорами.

Грамположительные бактерии делятся путем врастания внутрь клетки синтезирующихся перегородок деления, а грамотрицательные – путем перетяжки, в результате чего формируются гантелевидные фигуры, из которых образуются две одинаковых клетки. Делению клеток предшествует репликация бактериальной хромосомы по полуконсервативному типу, приводящая к удвоению молекул ДНК нуклеоида.

Образовавшиеся в результате репликации две хромосомы расходятся, чему способствует увеличение размеров растущей клетки. По мере увеличения объема клетки прикрепленные к ЦПМ хромосомы удаляются друг от друга. Окончательное их обособление завершается образованием перетяжки или перегородки деления. Клетки с перегородкой деления расходятся в результате действия аутолитических ферментов, которые разрушают сердцевину перегородки деления.

Аутолиз может происходить неравномерно, и тогда делящиеся клетки в одном участке остаются связанными частью клеточной стенки в области перегородки деления. Такие клетки располагаются под углом друг к другу, что характерно для дифтерийных коринебактерий.

Размножение бактерий в жидкой питательной среде. Бактерии, засеянные в определенный, не изменяющийся объем питательной среды, размножаясь, потребляют питательные элементы, что приводит к истощению среды и прекращению роста бактерий. Культивирование бактерий в такой системе называется периодическим культивированием, а культуру – периодической. Если же условия культивирования поддерживаются путем непрерывной подачи свежей питательной среды и оттока такого же объема культуральной жидкости, то такое культивирование называется непрерывным, а культура – непрерывной. При выращивании бактерий на жидкой питательной среде наблюдаются: придонный рост, диффузное помутнение среды, образование пленки на поверхности среды.

Рост бактерий на жидкой среде подразделяют на несколько фаз или периодов.

І. Исходная стационарная фаза (1-2 часа) – время от момента посева до начала роста.

ІІ. Lag-фаза (запаздывание) – период между посевом бактерий и началом размножения. В лаг-фазе не увеличивается число клеток, но идет метаболизм, увеличивается количество белка, РНК, размеры, и остается неизменным количество ДНК. Идет фенотипическая и генотипическая адаптация к среде, синтезируются индуцибельные ферменты. Продолжительность фазы 4-5 часов.

ІІІ. Log-фаза (фаза логарифмического роста). Характеризуется максимальной скоростью размножения бактерий для данной среды. Число клеток в культуре возрастает в геометрической прогрессии. Продолжительность 5-6 часов. Большинство видов бактерий делится каждые 20-30 мин, хотя существуют виды (микобактерии туберкулеза), которые делятся каждые 18 часов.

ІV. Фаза отрицательного ускорения – начинается замедление размножения из-за истощения питательной среды (около 2 ч).

V. Стационарная фаза максимума – когда количество погибших клеток равно количеству вновь появившихся. Она характеризуется М-концентрацией (концентрация микробных клеток в единице объема достигает максимума, длительность фазы составляет 2 ч).

VI. Фаза ускорения гибели (3 ч).

VII. Фаза логарифмической гибели, когда отмирание клеток происходит с постоянной скоростью (5 ч).

VII. Фаза уменьшения скорости отмирания –остающиеся в живых особи переходят в состояние покоя.

Продолжительность фаз гибели колеблется от десятка часов до нескольких недель.

Размножение бактерий на плотной питательной среде. Бактерии, растущие на плотной питательной среде, образуют изолированные колонии, которые представляют собой видимые скопления особей одного вида микроорганизмов, образующихся из одной или нескольких клеток.

Колонии бывают выпуклыми, плоскими, куполообразными, вдавленными. Поверхность их – гладкой (S-формы) или шероховатой (R-формы), края – ровные или неровные. Форма колоний может быть различной: круглая, розеткообразная, звездчатая и др. По величине колонии подразделяют на крупные (4-5 мм в диаметре), средние (2-4 мм), мелкие (1-2 мм) и карликовые (меньше 1 мм).

Колонии отличаются также по консистенции (сухие, слизистые, влажные), цвету, который зависит от наличия пигментов.

Характер роста на плотных и жидких питательных средах относят к культуральным свойствам бактерий.