Заглавная страница
Избранные статьи
Случайная статья
Познавательные статьи
Новые добавления
Обратная связь

ТОП 10 на сайте

Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрации

Техника нижней прямой подачи мяча.

Франко-прусская война (причины и последствия)

Организация работы процедурного кабинета

Смысловое и механическое запоминание, их место и роль в усвоении знаний

Коммуникативные барьеры и пути их преодоления

Обработка изделий медицинского назначения многократного применения

Образцы текста публицистического стиля

Четыре типа изменения баланса

Задачи с ответами для Всероссийской олимпиады по праву

Мы поможем в написании ваших работ!

ЗНАЕТЕ ЛИ ВЫ?

Влияние общества на человека

Приготовление дезинфицирующих растворов различной концентрации

Практические работы по географии для 6 класса

Организация работы процедурного кабинета

Изменения в неживой природе осенью

Уборка процедурного кабинета

Сольфеджио. Все правила по сольфеджио

Балочные системы. Определение реакций опор и моментов защемления

Главная Избранные Случайная статья Познавательные Новые добавления Обратная связь FAQ

Проблема адаптации и дезадаптации микроорганизмов к внешней среде

Стр 1 из 8Следующая ⇒

Реферат

Курсовая работа содержит 64 с., 11 таблиц, 10 рисунков, 24 источников.

МИКРООРГАНИЗМЫ, АДАПТАЦИЯ, ДЕЗАДАПТАЦИЯ, КУЛЬТИВИРОВАНИЕ, ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА, БИОКАЛОРИМЕТРИЯ, БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ, ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ, РЕДУКТАЗНАЯ АКТИВНОСТЬ, БИОЭНЕРГЕТИКА, ГЕНЕРАЦИЯ ВОДОРОДА, ЧИСТЫЕ КУЛЬТУРЫ, КАЛИБРОВОЧНЫЕ ЗАВИСИМОСТИ, МИКРОКАЛОРИМЕТР.

Целью выполнения данного курсового проекта является определение общего количества микроорганизмов методом культивирования, а так же изучение процессов адаптации и дезадаптации микроорганизмов, биокалориметрического анализа и биоэнергетического анализа функциональных состояний микроорганизмов.

В курсовом проекте рассмотрены процессы адаптации и дезадаптации микроорганизмов. Проанализированы оптимальные условия и предельные возможности адаптации микроорганизмов, а так же скорость адаптации. Так же рассмотрены различные методы контроля адаптации и дезадаптации. В экспериментальной части были получены чистые культуры микроорганизмов и определено их общее количество методом культивирования. А так же были построены калибровочные зависимости по спектру мутности.

Содержание

Введение. 5

1 Основная часть. 6

1.1 Проблема адаптации и дезадаптации микроорганизмов к внешней среде. 6

1.1.1 Адаптация и эволюция микроорганизмов. 6

1.1.2 Биоэнергетические и генетические основы адаптации и дезадаптации м/о. 11

1.1.3 Оптимальные условия и предельные возможности адаптации м/о. 13

1.1.4 Скорость адаптации и дезадаптации м/о. 20

1.2 Методы контроля адаптации и дезадаптации м/о к среде. 20

1.2.1 Оценка времени адаптации микроорганизмов к среде. 20

1.2.2 Оценка предельных возможностей адаптации м/о к антимикробным веществам. 36

1.2.3 Методы анализа скорости дезадаптации м/о…………………………....……..41

1.3 Биокалориметрический анализ биологической активности и содержания м/о почв 41

1.3.1 Биокалориметрический метод определения содержания м/о в средах. 41

1.3.2 Оценка уровня биологичекой активности почв. 42

1.3.3 Метод индуцированного тепловыделения. 43

2 Экспериментальная часть. 45

2.1 Материалы, реактивы и питательные среды 45

2.2 Микроорганизмы и питательные среды.. 45

2.3 Методы анализа. 49

2.4 Результаты и их обслуждение. 62

Заключение. 64

Список использованной литературы……………………………………………. 65

Введение

Биологическая адаптация (от лат. adaptatio — приспособление) — приспособление организма к внешним условиям в процессе эволюции, включая морфофизиологическую и поведенческую составляющие. Адаптация может обеспечивать выживаемость в условиях конкретного местообитания, устойчивость к воздействию факторов абиотического и биологического характера, а также успех в конкуренции с другими видами, популяциями, особями. Каждый вид имеет собственную способность к адаптации, ограниченную физиологией (индивидуальная адаптация), пределами проявления материнского эффекта и модификаций, эпигенетическим разнообразием, внутривидовой изменчивостью, мутационными возможностями, коадаптационными характеристиками внутренних органов и другими видовыми особенностями.

Приспособленность живых существ к естественным условиям внешней среды была осознана людьми ещё в античные времена. Вплоть до середины XIX века это объяснялось изначальной целесообразностью природы. В теории эволюции Чарлза Дарвина было предложено научное объяснение адаптационного процесса на основе естественного отбора.

Адаптации видов в рамках одного биоценоза зачастую тесно связаны друг с другом [1]. Если адаптационный процесс у какого-либо вида не находится в равновесном состоянии, то эволюционировать может весь биоценоз (иногда — с негативными последствиями) даже в стабильных условиях окружающей среды.

Процесс развития жизни на земле предполагает наличие адаптации у организмов. Начинается эта адаптация с самых примитивных видов — приспособления к окружающей среде и к существующим условиям. Возникновение и выживание организмов возможно только при соответствии организмов окружающей среде. Выживают те организмы, которые вырабатывают лучшие формы своего сохранения. Их развитие, переход организмов на более высокую ступень обусловлены необходимостью адаптации. Таким образом, эволюция и адаптация суть процессы, неотделимые друг от друга.

На сегодняшний день изучение адаптации и дезадаптации является актуальной темой.

Основная часть

Проблема адаптации и дезадаптации микроорганизмов к внешней среде

Проблема адаптации и дезадаптации микроорганизмов к внешней среде состоит в том, что они находятся в тесной зависимости от условий окружающей среды. Чем более благоприятны для данного микроорганизма условия, тем интенсивнее идет его развитие и тем выше его жизнедеятельность. Если какой-нибудь фактор продолжительное время удерживается на одном уровне (рН, температура), то он вызывает изменчивость микроорганизмов. Так появляются новые расы, приспособленные к данным условиям.

Факторы внешней среды, оказывающие значительное влияние на развитие микроорганизмов, можно разделить на три группы: 1) физические, 2) химические и 3) биологические.

Из физических факторов наибольшее влияние на бактерии оказывают температура, свет, влажность. Из химических факторов наибольшее влияние оказывают – реакция среды и различные химические соединения.

Методы контроля адаптации и дезадаптации микроорганизмов к среде

Существуют следующие группы методов адаптации и дезадаптации микроорганизмов к среде:

Микробиологические методы.

Оптическую плотность (ОП) - светорассеяние клеточной суспензии можно измерить нефелометрически (λ=540, 600 или 650 нм, l=10 мм).

Массу сухих клеток (МСК) можно определять после их высушивания до посто-янной массы в течение 24 часов при температуре 105 ⁰С.

Жизнеспособность клеток можно определить по количеству колониеобразующих единиц (КОЕ) при высеве клеточных суспензий из ряда десятичных разведений на агаризованные среды.

Термоустойчивость клеток определяют после прогрева клеточных суспензий в ультратермостате «UV-10» при соответствующих температурах в течение определённого времени с последующим определением числа КОЕ.

Радиоустойчивость клеток определяют по сохранению ими жизнеспособности (КОЕ) через 30 мин и 2 часа после γ-облучения интенсивностью 194 рад/с (установка ГУРХ 100000, γ-60Со).

Устойчивость дрожжей к синглетному кислороду (1О2) определяют в клетках, фото-сенсибилизированных хлорином е6, при их облучении монохроматическим лазером с λ=662 нм (20 мВт/см2) с последующим определением числа КОЕ.

Устойчивость к антибиотикам бактерий определяют, рассчитывая индекс ингибирования роста культуры IE=(1-ΔОПопыт/ΔОПконтр)х100.

Микроскопические наблюдения проводят в микроскопе «Amplival» (Германия) с фазово-контрастным устройством.

Скорости роста и иные показатели роста бактериальных культур при изучении действия адаптогенов можно определять по:

1) динамике светорассеяния их культур (λ=540, 600 или 650 нм - ОП540, ОП600, ОП650, КФК-2, КФК-56М, PyeUnicam);

2) численности колониеобразующих единиц (КОЕ) при высеве аликвот культур на плотные среды (МПА, сусло-агар и др.);

3) интенсив-ности дыхания (выделению СО2), (ИК-анализатор «Инфралит», Германия).

2) Биохимические и физико-химические методы. В качестве химических ана-логов микробных АОБ можно использовать алкилрезорцины С7-АОБ (5-метилрезорцин) и С12-АОБ (4-гексилрезорцин) (99% чистоты, синтезированные в МГУТХТ). Соединения необходимо внести в реакционные среды в виде раствора в этаноле или в виде водорастворимых К-солей.

Концентрацию АОБ в образцах можно определить с помощью колориметрической реакции с диазониевым производным 3,3’-диметоксибензидина (реактивом Fast Blue B Salt diazotized (FBB), Sigma) [Tluscik et al., 1981].

Количество белка определяют колориметрически по методу Лоури [Lowry et al., 1951] или в реакции с Кумаси синим (Fluka) [Bradford, 1976].

Активность трипсина (Sigma) можно определять модифицированным методом Ансона [Грачева с соавт., 1982]. Значения Кm и Vmax трипсина определяли из зависимостей Лайнуивера-Бэрка.

Активность α- и β-амилаз (Fluka) определяются по количеству образующихся при гидролизе крахмала редуцирующих веществ с 3,5-динитросалициловой ки-слотой (Fluka) [Грачева с соавт., 1982; Miller, 1959].

Вязкость растворов белков можно определить вискозиметрическим методом [Алейникова, Рубцова, 1988].

Степень набухания белка можно определить по модифицированной методике [Зимон, Лещенко, 2001].

Гель-фильтрацию растворов белков можно проводить на колонке (35,0х2,5 см), заполненной сефадексом G-75 (Chemapol).

Продукты окисления АОБ определяются методом хроматомассспектрометрии (ХМС) на масс-спектрометре модели 5973 с газовым хроматографом модели 6890 (Hewlett Packrd, США), для детекции свободных радикалов можно использовать ЭПР-спектрометр (ЭПР-спектрометр ESR 70-03 XD/2, Bruker BioSpin). Для идентификации разделенных веществ так же можно использовать спектральные библиотеки NIST98 и Wiley275.

О физико-химических свойствах микробных адаптогенов можно судить по сохранению/потере ими биологической активности после:

1) инкубации при рН 1 или 11;

2) прогревания (100оС, 20 мин;

3) инкубации с протеиназой К (иммобилизованной на стекле, BDH, UK)(0,2 мг/мл, 2 ч, 30оС); 4) адсорбции на гидрофобном носителе (картридж Sep-Pak C18, Millipore, UK) с последующей элюцией метанолом.

Молекулярную массу адаптогенов можно оценить методом ультрафильтрации (фильтр Centriplus с мембраной YM Millipore, UK, для молекул с М=3-10 кДа или в камере типа "Amicon", Россия, с мембранами Diaflo РМ-10, с порогом отсечения молекул с М<10 кДа).

Антиоксидантную активность АОБ можно определить по реакции обесцвечивания красителя дихлорфенолиндофенолята натрия в присутствии препаратов, а также на приборе «Цвет Яуза-01-АА».

Молекулярную динамику лизоцима, модифицированного С7-АОБ и С12-АОБ, можно исследовать методами Рэлеевского рассеяния Мёссбауэровского излучения (РРМИ), диффузного рассеяния рентгеновских лучей (ДРРЛ) и молекулярно-динамического компьютерного моделирования (МДКМ) (в лаборатории молеку-лярной динамики ИХФ им. Н.Н. Семёнова РАН, д.ф.н., проф. Ю.Ф. Крупянский).

3) Генетические методы. Генотоксическое (мутагенное) или антимутагенное действие алкилоксибензолов можно выявить в стандартном тесте без метаболической активации [Maron, Ames, 1983] с ауксотрофным по триптофану штаммом В1733 Bacillus subtilis trpA5. Предварительно оценить рост-ингибирующую активность алкилоксибензолов (С7-, С12-АОБ) по их влиянию на развитие этого штамма.

Для исследования влияния АОБ на активность стрессовых генов SOS-ответа (umuD) и rpoS -регулона (osmE) можно получить тестерные штаммы на основе E.coli c600 thi, thr, leu Δ pro-lac со встроенной малокопийной плазмидой pJEL246, несущей гибридные опероны umuD::lacZ и osmE::lacZ (во ВНИИГенетика, д.б.н., проф. А.С. Миронов). Об уровне экспрессии стрессовых генов можно судить по активности β-галактозидазы, которую можно определить по расщеплению субстрата (о-нитрофенил-β-галактопиранозида) [Грачёва, 2005].

4) Методы идентификации микробных антиадгезинов. Антиадгезин P.fluorescens можно получить твердофазной экстракцией культуральной жидкости на колонке с гидрофобным сорбентом (Sep-Pak C18, Millipore) и идентифицировали методом хромато-масс-спектрометрии на хроматографе 6890 и масс-спектрометре 5973 (Hewlett Packard) с использованием спектральных библиотек Willey275 и NIST98 по программе ChemStation (Hewlett Packard).

Антиадгезины B.licheniformis можно получить методами колоночной хроматографии на силикагеле L100/160 (Lachema, Czech Republic) и тонкослойной хроматографии на пластинах с силикагелем (Merck, Germany) с выявлением аминной, амидной, эфирной, диольной, фосфатной групп [Vaskovsky, Latyshev, 1975; Kates, 1986]. Состав жирных кислот можно определить методом ХМС [Batrakov et al., 2003]. Аминокислотный состав определяется методами ТСХ и ХМС. ИК-спектры снимали на спектрометре Specord 71 (Carl Zeiss, Germany), в таблетках KBr. Спектры 13С-ЯМР получали на установке Unity Plus instrument (Varian, USA) [Batrakov et al., 2003].

5) Биотесты для обнаружения ВА. Для выявления ВА, влияющих на рост мик-роорганизмов, в тест-культуры опытных вариантов фазы экспоненциального роста необходимо внести культуральные жидкости (КЖ) (до 50% об.) от культур, подвергшихся действию стрессора (тетрациклин, окислитель N-этилмалеимид (NEM), выдерживание при 44-50 ⁰С или 5-15 ⁰С в течение 1 ч) или от культур, растущих в обычных, не стрессовых, условиях – контрольные варианты. КЖ можно получить, отделяя клетки центрифугированием и мембранной фильтрацией (Ø пор 0.2 мкм). О наличии ВА судят по изменению скорости роста или по уменьшению лаг-периода опытных и контрольных культур, растущих в стрессовых или стандартных условиях, соответственно.

Экспериментальная часть

Материалы и оборудование

Посев микроорганизмов подразумевает внесение клеток или материала, содержащего клетки, в (или на) питательную среду для последующего культивирования. Основные инструменты, используемые для проведения экспериментальной части по данной теме необходимы следующие материалы, реактивы и оборудование:

–стерильныепипетки;

–бумажные фильтры;

– спиртовка;

– спирт;

– спички;

– ультратермостат;

– суховоздушные термостаты на 30 и 37ºС;

– стеклянные палочки;

– шпатели металлические и ли стеклянные;

– иглы:

– бактериальная петля;

– микробиологические петли;

– спиртовая горелка;

– стерильные пробирки;

– стерильные чашки Петри;

– штатив для пробирок;

– стерилизатор;

– дистиллированная вода;

– питательные среды для микроорганизмов (питательный агар, физиологичес-кий раствор);

– культуры микроорганизмов (культуры дрожжей, бактерий, грибов) на плотной среде;

– микрокалориметр МКМ–Ц.

Чтобы обеспечить правильность проведения эксперимента и избежать загрязнения, необходимо предварительно простерилизовать подготовленные инструменты, перед началом проведения экспериментальных работ.

Методы анализа

Результаты и их обсуждения

Таблица 1 – Результаты эксперимента

Название параметра	Бактерии рода Bacillus subtilis	Грибы рода Aspergillus niger	Дрожжи рода Saccharomyces cerevisiae

a
f
v
Ni	9,0*10¹	6,4*10¹		2*10²	2,1*10²
Nср	7,7*10¹	2,5	2,05*10²
СКО	1,3*10¹	5*10^-1	0,5*10²
ε	16,9%	20%	2,43%
Результат	(7,7±1,3)*10¹	2,5±0,5	(2,05±0,5)*10²

Таблица 2 – Результаты полученные после первого разведения

Название параметра	Бактерии рода Bacillus subtilis	Грибы рода Aspergillus niger	Дрожжи рода Saccharomyces cerevisiae

a
f
V
Ni	5*10³	3,95*10³	2*10²	3*10²	1*10³	1,6*10³
Nср	4,48*10³	2,5*10¹	1,3*10³
СКО	5,25*10²	0,5*10¹	3,0*10²
ε	11,7%	20%	23,1%
Результат	(44,8±5,25)*10²	(2,5±0,5)*10¹	(13,0±3,0)*10²

Таблица 3 – Результаты полученные после второго разведения

Название параметра	Бактерии рода Bacillus subtilis	Дрожжи рода Saccharomyces cerevisiae

a
f
v
Ni	4,5*10⁴	4,1*10⁴	2,15*10⁴	2,8*10⁴
Nср	4,3*10⁴	2,475*10⁴
СКО	2*10³	3,25*10³
ε	4,7%	13,1%
Результат	(43,0±2)*10³	(24,75±3,25)*10³

Таблица 4 – Результаты после третьего разведения

Название параметра	Дрожжи рода Saccharomyces cerevisiae

a
f
v
Ni	5*10⁴	3*10⁴
Nср	4*10⁴
СКО	1*10⁴
ε	25%
Результат	(4±1)*10⁴

Результаты проведения измерения оптической плотности и рассчитанные значения мутности приведены в таблице 5.

Таблица 5 – Результаты измерения оптической плотности и рассчитанные значения мутности

Бактерии рода Bacillus subtilis	Грибы рода Aspergillus niger	Дрожжи рода Saccharomyces cerevisiae
Д₆₀₀	Ʈ, м^-1	Д₆₀₀	Ʈ, м^-1	Д₆₀₀	Ʈ, м^-1
0,13	7,69	0,03	33,3	1,1	0,91
0,08	12,5	0,01		0,9	1,11
0,03	33,3	-	-	0,7	1,43
-	-	-	-	0,5

Совместив расчеты общего количества микроорганизмов методом культивирования и значения мутности, построим калибровочную зависимость «мутность – количество м/о».

Таблица 6 – Результаты по мутности и количеству бактерий, дрожжей, грибы

Мутность	N_{бактерии}	мутность	N_дрожжи	мутность	N_грибы
7,69	7,7*10¹	0,91	2,05*10²	33,3	2,5
12,5	5,25*10²	1,11	1,3*10³
33,3	4,3*10⁴	1,43	2,5*10⁴
			4*10⁴

Построенные и аппроксимированные графические зависимости мутности от количества клеток микроорганизмов (бактерий, дрожжей и грибов), после соответствующих разбавлений, приведены на рисунках 1, 2 и 3, расположенных ниже.

Рисунок 1 – Калибровочная зависимость бактерий рода B. subtilis по спектру мутности

Рисунок 2 – Калибровочная зависимость дрожжей рода S. cerevisiae по спектру мутности

Рисунок 3 – Калибровочная зависимость грибов рода A. niger по спектру мутности

По данным калибровочным зависимостям видно, что с ростом клеток микроорганизмов мутность увеличивается.

Заключение

В ходе курсовой работы была проанализирована литература, касающаяся адаптации микроорганизмов. Были изучены различные методы контроля адаптации к среде. А так же рассмотрены вопросы касающеяся оптимальных условий и предельных возможностей адаптации микроорганизмов, метода индуцированного тепловыделения, скорости адаптации и дезадаптации микроорганизмов, оцекнки биологической активности почв.

В практической части курсовой работы были получены навыки не только культивирования микроорганизмов, но и изучен калориметрический способ определения количества выделяемого тепла, как микроорганизмами. По данным калибровочных зависимостей по спектру мутности было замечено, что с ростом клеток микроорганизмов мутность увеличивается.

Оценка редуктазной активности почвы – это метод определения бактериальной загрязнеености почвы, который проводился с метиленовым синим, по результатам анализа можно сделать вывод, что чем меньше содержания микроорганизмов, то тем больше время обесцвечивания метиленовой сини.

Анализ процессов адаптации микроорганизмов к биоцидным веществам в водной среде и почвы не получился, так как при исследовании тепловыделения микроорганизмов почвы в водной среде и с добавлением биоцида было замечено, что биоцид при таких концентрациях (0,5 %) является субстратом, микроорганизмы адаптированы к этому соединению.

Таким образом изученных метод анализа, а именно биокалориметрический метод, позволяет оценивать различные показатели и может широко применятся в промышленности.