Метод индуцированного тепловыделения

Точное измерение количества метаболического тепла связано с серьезными техническими трудностями. Имеет место противоречие между требованием контролируемости условий роста и специфическими требованиями корректности калориметрических измерений. При культивировании помимо метаболического тепла генерируется тепло техническое, связанное с аэрацией, перемешиванием и теплопотерями. Сам процесс калориметрии измерения требует законченности переходных процессов по тепловым потокам в объекте и окружающем его оборудовании. Таким образом, чем лучше проба подготовлена к калориметрическим измерениям, тем больше условия в клетках отличаются от истинных, поскольку наблюдается лимит как по газовому, так и органическому субстратам. Более перспективны в этом плане измерения, проводимые не с образцами, а с целым ферментером. Но в этом случае точность измерения меньше, чем при измерении тепла химических реакций. В этой связи более целесообразно использовать аналогию между выделением культурой тепла и потреблением ею кислорода. Такой зависимостью является среднее значение коэффициента пропорциональности

Q ₀ = 103,68 кДж/экв RO, которое справедливо на протяжении всего жизненного цикла клеток и вне зависимости от их возраста.

Метаболическое тепловыделение согласно [16] включает

 

r_Н = r_SH_S^RO - μ H_В^RO- r_PH_P^RO,

 

где r_Н – удельная скорость тепла в расчете на 1 экв. RO; H_S^RO, H_В^RO, H_P^RO –

энтальпии RO в субстрате, биомассе и продуктах.

При H_S^RO= H_В^RO = H_P^RO = H_O^RO уравнение имеет вид

 

r_Н = H_O^RO.

 

Степень точности последнего выражения тем больше, чем ближе друг к другу величины энтальпии, то есть когда образуется меньше продуктов метаболизма, и чем больше редоксонов субстрата уходит на кислород.

Показанная пропорциональность между тепловыделением и дыханием при аэробном росте имеет место при росте на любом органическом субстрате, так как конструктивный обмен протекает приблизительно на постоянном энергетическом уровне, а дыхательный обмен опускает редоксоны со стандартного уровня, имеющего место в органических соединениях до нуля.

Поэтому в случае аэробного роста в отсутствие большого количества продуктов метаболизма целесообразнее тепловыделение клетками измерять через скорость потребления кислорода.

В этой связи тепло Q, которое получила культуральная жидкость за время отключения системы термостатирования, можно представить в виде баланса

 

Q= Qб + Qм - Qп,

 

где Q б – тепло, выделяемое клетками, Дж/c;

Q м – тепло, выделяемое перемешивающим устройством при постоянной

мощности, Дж/c;

Q п – потери тепла в окружающую среду, Дж/c.

Тепло, выделяемое в окружающую среду, Q п определяется экспериментально с использованием стандартного нагревателя при калибровке в питательной среде без клеток. Аналогично тепло, выделяемое перемешивающими устройствами, также определяется опытным путем. Например, тепло выделяемое турбинной мешалкой биореактора BioFlo110 при 1200 об/мин и диаметре мешалки 80 мм, составляет 18–20 Дж/c. Тепло в рабочем объеме биореактора Q определяется на основании начальной и конечной температуры среды достигаемо за время отключения системы термостатирования.

Таким образом, из теплового баланса определяется скорость тепловыделения клеток, Дж/ч, а при помощи газоанализаторов скорость потребления кислорода G 02, моль O2/ч. После чего величина скорости потребления кислорода переводится в экв.редоксонов в час из расчета 4 экв. RO/моль O2. На основании полученных данных определяется отношение скорости тепловыделения к скорости дыхания Q б / G 02. кДж/экв.RO, которое составляет [16] 103,7 кДж/экв.RO.

Материалы и оборудование:

культура штамма R. eutrophus B-5786;

раствор базового фосфатного буфера для среды;

стерильные растворы микроэлементов, железа лимонно-кислого, сульфата магния и хлористого аммония;

установка для гетеротрофного культивирования, включающая теплоизолированный биореактор с турбинной мешалкой BioFlo110 и устройство

для термостабилизации подаваемого воздуха и насыщения его водяным па-

ром;

газоанализатор для измерения концентрации кислорода;

термометр Beckmann (точность 0,01 ^oC).

 

Экспериментальная часть

Материалы и оборудование

Посев микроорганизмов подразумевает внесение клеток или материала, содержащего клетки, в (или на) питательную среду для последующего культивирования. Основные инструменты, используемые для проведения экспериментальной части по данной теме необходимы следующие материалы, реактивы и оборудование:

–стерильныепипетки;

–бумажные фильтры;

– спиртовка;

– спирт;

– спички;

– ультратермостат;

– суховоздушные термостаты на 30 и 37ºС;

– стеклянные палочки;

– шпатели металлические и ли стеклянные;

– иглы:

– бактериальная петля;

– микробиологические петли;

– спиртовая горелка;

– стерильные пробирки;

– стерильные чашки Петри;

– штатив для пробирок;

– стерилизатор;

– дистиллированная вода;

– питательные среды для микроорганизмов (питательный агар, физиологичес-кий раствор);

– культуры микроорганизмов (культуры дрожжей, бактерий, грибов) на плотной среде;

– микрокалориметр МКМ–Ц.

Чтобы обеспечить правильность проведения эксперимента и избежать загрязнения, необходимо предварительно простерилизовать подготовленные инструменты, перед началом проведения экспериментальных работ.

Микроорганизмы и питательные среды

Питательные среды для культивирования микроорганизмов

Для проведения экспериментальной части курсового проекта необходимо приготовить питательные среды, которые будут использоваться для культивирования чистых культур микроорганизмов.

После приготовления, все питательные среды необходимо стерилизовать для предотвращения загрязнения.

Питательные среды применяют различной консистенции: жидкие, плотные, полужидкие. Плотные питательные среды используют для учета количества бактерий, выделения их в чистую культуру и других целей. Такие среды готовят из жидких, добавляя 1,5—2,5% агар-агара или 10—15% желатины. При приготовлении полужидких сред вносят агар-агар в количестве 0,1—0,2%.В данном курсовом проекте для культивирования чистых культур микроорганизмов используется питательный агар (ПА), как питательная среда. ПА готовят из коммерческого препарата «Питательный агар для культивирования микроорганизмов сухой», который содержит панкреатический гидролизат кильки, хлорид натрия и агар-агар. Обычно для приготовления плотной среды требуется вносить в среду дополнительное количество агар-агара. Поскольку эта среда содержит агар-агар, который растворяется в воде только при температуре выше 98ºС, навески порошка вносят во флаконы, заливают нужным объемом воды и стерилизуют автоклавированием при 1атм 20-30мин. Агар-агар — растительный коллоид, получаемый из некоторых морских водорослей. В его состав входят главным образом полисахариды с ничтожным содержанием азотистых веществ. Эта питательная среда относится к плотным питательным средам.

Чаще всего на практике используют следующие питательные среды:

1.Физиологический раствор (ФР). 8,5 г хлористого натрия растворяют в 1л дистиллированной воды. Стерилизуют при 0,15 МПа в течении 20 минут.

2. Среда Кеслер. 16 г сухой среды Кеслер растворяют в 1 л дистиллированной воды. Смесь перемешивают и кипятят при перемешивании 25 мин. Объем доводят дистиллированной водой до 1л и фильтруют через вату.

3. Среда Энда. 5 г сухой среды помещают в колбу со 100 мл дистиллированной среды и перемешивают. Кипятят до полного растворения агара. Фильтруют и снова доводят до кипения. Охлаждают и разливают в чашки Петри.

4. Питательный бульон (ПБ). Готовят из гидролизата рыбного концентрированного. Для приготовления 1 л ПБ 40 г пасты растворяют в 1 л дистиллированной воды, доводят до кипения, после охлаждения фильтруют.

5. Сусло – агар (СА). Неохмеленное солодовое сусло разводят дистиллированной водой. К 1 л разбавленного сусла добавляют 20 г агар – агара. Среду расплавляют на водяной бане и фильтруют. Затем стерилизуют при 0,12 МПа в течении 20 минут.