Оценка предельных возможностей адаптации микроорганизмов к антимикробным веществам

Исследования антибиотикорезистентности показаны, если уровень устойчивости микроорганизма к антибактериальным препаратам не может быть предсказан на основании данных идентификации или вероятной таксономической принадлежности микроорганизма.

Исследованию по оценке антибиотикорезистентности подлежат чистые культуры микроорганизмов или материал изолированных колоний с плотных питательных сред после первичного посева клинического образца, в последнем случае параллельно необходимо провести идентификацию культуры.

Исследовать в практических целях микроорганизмы, для которых методы изучения антибиотикорезистентности в настоящее время недостаточно стандартизованы или отсутствуют обоснованные критерии оценки, не рекомендуется. Данные, полученные при исследовании чувствительности, таких микроорганизмов не могут служить основанием для назначения антибактериального препарата, если соответствующая нозологическая форма не приведена в утвержденной инструкции по его применению. С крайней осторожностью следует также оценивать факты выявления резистентности у микроорганизмов, для которых этот феномен ранее не был описан в научной литературе. Полученные штаммы рекомендуется отправлять в референтные лаборатории и специализированные учреждения для проверки.

Определение показаний для оценки антибиотикорезистентности микроорганизмов является обязанностью врача-бактериолога.

Обязательному исследованию на антибиотикорезистентность подлежат все микроорганизмы, выделенные из первично стерильных жидкостей, органов и тканей человека.

Следует уделять внимание изучению антибиотикорезистентности микроорганизмов, относящихся к таксономическим группам, для которых характерна высокая частота распространения приобретенной устойчивости.

Микроорганизмы, проявляющие универсальную чувствительность к каким-либо антибиотикам (случаев развития резистентности не описано) исследовать на антибиотикорезистентность в повседневной практике не целесообразно, например: Streptococcus pyogenes – все штаммы чувствительны к пенициллину.

Диско-диффузионный метод оценки антибиотикочувствительности

Принцип метода

Принцип диско-диффузионного метода (по Keurby-Bauer) основан на феномене ингибиции антибиотиком поверхностного, видимого роста микроорганизмов на плотной (агаровой) питательной среде. Градиент концентрации антибиотика в питательной среде создается в результате его диффузии из носителя (картонного диска). Диск с антибиотиком помещается на поверхность питательной среды немедленно после посева (инокуляции) культуры исследуемого микроорганизма. При этом практически одновременно начинаются два процесса: диффузия антибиотика из диска и рост микроорганизмов на поверхности среды. С практической точки зрения важно то, что от диска к периферии происходит движение “фронта” концентрации антибиотика, равной его МПК в отношении исследуемого микроорганизма.

Особенностью роста микроорганизмов на питательных средах является наличие лаг-фазы – периода времени, в течение которого происходит адаптация культуры к новой среде. По окончании лаг-фазы рост культуры исследуемого микроорганизма начинается в тех областях, где концентрация антибиотика еще не превысила минимальную подавляющую. Таким образом, чем длиннее лаг-фаза у данного микроорганизма, тем большим окажется диаметр зоны ингибиции роста вокруг диска с антибиотиком. Диско-диффузионный метод в настоящее время стандартизован только для “быстрорастущих” микроорганизмов (формирующих гомогенный сплошной рост – “газон” через 18 – 20 ч инкубации.

Учитывая закономерности зонообразования очевидно, что для получения с помощью диско-диффузионного метода воспроизводимых результатов необходима стандартизация всех этапов исследования.

· Приготовление и состав питательной среды

· Приготовление суспензии исследуемого микроорганизма заданной концентрации

· Минимизация интервала времени между инокуляцией микроорганизма и нанесения на поверхность среды дисков.

· Соблюдение температурного и временного режима инкубации.

Методика проведения исследования

Приготовление питательной среды Мюллера Хинтона

Агаровая среда Мюллера Хинтона представляет собой стандартную питательную среду соответствующую нормам ВОЗ.

на 1000 мл дистиллированной воды:

- Лиофилизат настоя, приготовленного из 300 гр. говяжьего мяса

- Гидролизат казеина: 17,5 г

- Кукурузный крахмал: 1,5 г

- Агар-агар: 10 г

- рН 7,3 ± 0,1 после автоклавирования

Содержание двухвалентных катионов

· ионов Mg2+ содержится от 20 до 35 мг/л.

· ионов Са2+ содержится от 50 до 100 мг/л.

Концентрация тимидина должна быть меньше 50 нг/л

Агар Мюллера Хинтона выпускается микробиологическими фирмами производителями в нескольких видах:

· в чашках Петри, готовых к использованию, с добавками для роста микроорганизмов со сложными питательными потребностями или без них.

· во флаконах различного объема, содержимое которых необходимо растапливать и разливать в лаборатории по чашкам Петри

· в сухом виде для приготовления среды в лабораторных условиях

При использовании питательной среды, разлитой в чашки Петри в заводских условиях, необходимо лишь выполнять рекомендации изготовителя по условиям хранения и сроку годности.

При приготовлении питательной среды в лабораторных условиях необходимо руководствоваться инструкцией изготовителя, после чего разлить расплавленную среду в чашки Петри.

Перед заполнением расплавленной средой чашки Петри устанавливают на строго горизонтальную поверхность (выверенную по уровню, без впадин и выпуклостей). Глубина агарового слоя в чашке должна быть 4.0 мм, что достигается при внесении 25 – 30 мл расплавленного агара в чашку диаметром 100 мм или 60 – 70 мл в чашку диаметром 150 мм. Соблюдение указанных предосторожностей необходимо в связи с тем, что размер и форма зоны ингибиции роста зависят от глубины и равномерности агарового слоя.

После заполнения чашки оставляют при комнатной температуре для застывания. При использовании свежеприготовленных чашек перед инокуляцией их необходимо подсушить, что достигается инкубацией при 37°С с приоткрытой крышкой в течение 10 – 20 мин.

Хранить чашки можно запаянными в полиэтиленовые пакеты при +4 – +8°С, в течение 7 – 10 сут. При использовании чашек после хранения в холодильнике их также необходимо подсушить в течение 10 – 20 мин при 37°С с приоткрытой крышкой.

Перед инокуляцией необходимо проконтролировать отсутствие конденсата жидкости на внутренней поверхности крышек.

Контроль качества питательной среды

Наиболее приемлемым для практических лабораторий способом контроля качества питательных сред является оценка чувствительности референтных штаммов с последующим сравнением полученных результатов с паспортными данными штамма.

В первую очередь необходимо использовать штамм Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853. Среду следует считать удовлетворительной по качеству, если диаметр зоны ингибиции вокруг диска, содержащего 10 мкг гентамицина находится в пределах 16 – 21 мм. Выбор гентамицина для контроля качества связан с тем, что аминогликозидные антибиотики наиболее чувствительны к колебаниям концентрации двухвалентных катионов.

Для контроля среды на наличие антагонистов сульфаниламидных препаратов и триметоприма рекомендуется использовать штамм Enterococcus faecalis ATCC 29212. При величине зоны ингибиции вокруг диска, содержащего 1.25/23.75 мкг триметоприма/сульфаметоксазола 20 мм и более среду следует признать удовлетворительной по качеству.

Количественная оценка при интерпретация зон подавления роста, основанная на использовании агара Мюллера Хинтона, не всегда применима к другим средам, например, часто используемой среде АГВ.

Диски с антибиотиками

Диски выпускаются фирмами-производителями (в частности фирмой bioMerieux*) в стандартной упаковке (см. Приложение 1) с 50 дисками или в стандартной таре, содержащей 4, 10 или 18 упаковок. Упаковки удобны для пользователя, герметичны, содержат поглотитель влаги.

Диаметр дисков, согласно рекомендациям ВОЗ, составляет 6,35 мм. На каждый диск нанесена аббревиатура, состоящая из 1, 2 или 3 букв. Хранить диски необходимо в сухом месте при + 2-8°С.

Приготовление материала для инокуляции и посев

Для приготовления инокулята используют 18 – 20-ти часовую агаровую или 5 – 6-ти часовую бульонную культуру исследуемого микроорганизма. Суспензию из агаровой культуры или бульонную культуру доводят до мутности стандарта 0.5 McFarland и разводят еще в 10 раз изотоническим раствором хлорида натрия (конечная концентрация 1 – 2 х 107 КОЕ/мл). Для стандартизации суспензии возможно также использовать спектрофотометр, руководствуясь паспортными данными прибора или инструкцией по его применению.

Приготовленный таким образом инокулят наносят в количестве 1 – 2 мл на поверхность чашки Петри с питательной средой, равномерно распределяют по поверхности покачиванием и удаляют избыток жидкости пипеткой. Приоткрытые чашки подсушивают при комнатной температуре в течение 10 – 15 мин.

Однако более практичным способом инокуляции является использование коммерческих стерильных ватных тампонов. Тампон необходимо погрузить в суспензию микроорганизма, избыток влаги удаляют отжимая тампон о стенку пробирки. Инокуляцию на поверхность агаровой среды проводят штриховыми движениями, периодически поворачивая чашку Петри на 60°.

Аппликация дисков

Разместить диски с соответствующими антибиотиками на поверхности агара, выдерживая расстоянии 15 мм от края чашки и не менее 30 мм между дисками.

Расстояние между центрами дисков (30 мм) позволяет обычно избегать интерференции между антибиотиками, но иногда в антибиограмме может быть обнаружен синергизм или антагонизм. Так, расположенные на расстоянии больше 60 мм между центрами, диски с триметопримом и с сульфамидом определяют чувствительность каждый к своему препарату. При расположении их на более близком расстоянии наблюдается эффект синергизма при слиянии зон просветления. Синергизм (несимметричные зоны) могут также наблюдаться в случае устойчивости к одному или другому из компонентов.

Для обеспечения хорошей постоянной диффузии антибиотика плотно прижать каждый диск к поверхности агара.

Оптимизировать стадию аппликации можно с помощью диспенсеров (распределителей дисков), которые выпускают различные микробиологические фирмы.

Оценка результатов

После окончания инкубации чашки помещают кверху дном на темную матовую поверхность так, чтобы свет настольной лампы падал на них под углом в 45° (учет в отраженном свете). Диаметр зон задержки роста с учетом диаметра самого диска измеряют с точностью до 1 мм, предпочтительнее пользоваться штангенциркулем или кронциркулем. При измерении зон задержки роста следует ориентироваться на полную ингибицию видимого роста. Не следует обращать внимания на очень мелкие колонии, выявляемые в пределах зоны задержки роста только при особых условиях освещения или увеличении, и едва заметный налет у края зоны. Крупные колонии, выявляемые в пределах четкой зоны ингибиции роста, свидетельствуют о наличии посторонней микрофлоры или о гетерорезистентности популяции, в этом случае необходима повторная идентификация и повторение исследования на антибиотикорезистентность.

При оценке антибиотикорезистентности роящихся штаммов протея, зона задержки роста может быть затянута тонкой вуалеобразной пленкой, которая не мешает установлению границы зоны.

При оценке резистентности к сульфаниламидам и их комбинации с триметопримом границу зоны ингибиции роста следует учитывать на уровне ингибиции роста на 80%. Это связано с тем, что под действием этих препаратов перед полной ингибицией роста возможно завершение 1 – 2-х циклов пролиферации микроорганизма.

В отличие от описанного выше метода учета результатов, при оценке антибиотикорезистентности стафилококков в отношении оксациллина необходимо учитывать и самые мелкие колонии, выявляемые в пределах четкой зоны ингибиции роста.

Для интерпретации полученных результатов используют таблицы, в которых приведены пограничные значения зон ингибиции роста, позволяющие отнести исследуемую культуру микроорганизма к одной из трех категорий: “чувствительный”, “промежуточный”, “устойчивый”.

1. При отнесении штамма к категории “чувствительный” предполагается, что лечение инфекционной болезни, вызванной данным микроорганизмом, соответствующим антибиотиком в обычных терапевтических дозах будет, скорее всего, успешным.

2. При отнесении штамма к категории “промежуточный” предполагается, что лечение инфекционной болезни, вызванной данным микроорганизмом, соответствующим антибиотиком может быть успешным лишь при использовании повышенных доз препарата или при локализации инфекции в тех локусах человеческого организма,где антибиотик способен концентрироваться в силу его фармакокинетических особенностей (моча).

3. При отнесении штамма к категории “резистентный” предполагается, что лечение инфекционной болезни, вызванной данным микроорганизмом, соответствующим антибиотиком даже в повышенных дозах будет, скорее всего, неудачным.

Поскольку диаметр зоны ингибиции роста исследуемого микроорганизма, получаемый при постановке диско-диффузионного метода в определенных пределах жестко связан с величиной МПК антибиотика, каждому пороговому значению МПК соответствует определенная пороговая величина диаметра зоны ингибиции роста.

Однако в некоторых случаях корреляции между величиной МПК и диаметром зоны ингибиции роста не наблюдается (бета-лактамные антибиотики и пневмококки), в такой ситуации для оценки чувствительности необходимо использовать метод серийных разведений, диско-диффузионный метод не приемлем.

Необходимо обратить внимание на то, что для различных микроорганизмов критерии чувствительности к одним и тем же антибиотикам могут различаются.