Влияние рН на жизнедеятельность микроорганизмов

Кислотность – важный фактор среды, определяющий существование в ней микроорганизмов.

Концентрация ионов водорода в окружающей среде может действовать на микроорганизмы прямо (непосредственное воздействие Н⁺) или косвенно, т.е. через влияние на ионное состояние веществ, делая их доступными или недоступными для микроорганизмов.

У неспециализированных бактерий экстремальные значения рН среды влияют на клеточную стенку и ЦПМ. В результате диссоциации или протонирования входящих в их состав макромолекул (липополисахаридов, белков и т.д.) происходят изменения в локальном распределении заряда на клеточных покровах. Это приводит к изменению морфологии клеток, нарушению деления клеток, к нарушению адгезии, а также к разрушению ЦПМ. Разрушаются поверхностные белки клеточной стенки, нарушается транспорт питательных веществ в клетку.

Некоторые не токсичные для человека кислоты (уксусная, пропионовая, сорбиновая, бензойная (0,1% р-р)) используются как консерванты в производстве пищевых продуктов. Борная, бензойная, уксусная, салициловая кислоты, раствор аммиака используют как антисептики.

Прокариоты могут развиваться в диапазоне рН от 1 до 12.

В зависимости от рН среды микроорганизмы делят на несколько групп:

1. Нейтрофилы развиваются при значении рН, близком к нейтральному (opt рН 6-8), диапазон от 4 до 9. Многие виды растут или выдерживают более низкие или высокие значения рН, соответственно их относят к ацидотолерантным или алкалотолерантным. К ацидотолерантным относятся молочнокислые, уксуснокислые. К алкалотолерантным – энтерококки, устойчивые к рН 9-10. Большинство природных местообитаний (пресноводные озера и реки, многие почвы, внутренняя среда растительных и животных организмов) имеют близкую к нейтральной реакцию среды; рН пресной воды – 7. Морская вода является слабощелочной (рН 7,5 – 8).

2. Ацидофилы -кислотолюбивые микроорганизмы.

Их делят на две группы:

1. облигатные – диапазон рН от 1 до 5, opt рН 2-4. Утратили способность расти в нейтральной среде.

2. факультативные - диапазон рН от 1 до 9, opt 2-4. Способны расти в нейтральных условиях.

Места обитания. Самая кислотоустойчивая бактерия Thiobacillus thiooxidans, образует большие количества серной кислоты (окисляет H₂S до H₂SО₄) и способна находиться в жизнеспособном состоянии даже в 1 N р-ре H₂SО₄, обитает в рудничных отходах (окисляет сульфидные руды).

В болотах, торфяниках (рН 2,5-6) развиваются умеренные ацидофилы. Термофильные ацидофилы р. Thermoplasma – в саморазогревающихся угольных отвалах (рН 2, t 32-80°С). Термофильная Sulfolobus (рН 2-3, opt t 70-80) – в горячих кислых источниках.

 

3.Алкалофилы – щелочелюбивые микроорганизмы делят на две группы:

1. облигатные – диапазон рН от 8,5 до 12, opt рН 9-11.

2. факультативные – диапазон рН от 5 до 12, opt рН 9-10,5.

Места обитания. Щелочные почвы, (не выше 8,5), обогащенные щелочными минералами или экскрементами животных; пустынные почвы (рН может достигать 10); щелочные озера и источники в Кении (рН 8-11); содовые озера (рН ~ 10) – обитают натронобактерии.

К алкалофилам относятся уробактерии и многие цианобактерии.

Механизмы рН-гомеостаза

рН-гомеостазом называют поддержание рН цитоплазмы (внутриклеточного рН) в пределах узкого диапазона, несмотря на изменения рН среды.

Гомеостаз достигается совместным действием активных и пассивных механизмов.

Пассивный гомеостаз

1. Барьером для проникновения протонов в клетку служит ЦПМ. Т.к. ЦПМ обладает низкой проницаемость для протонов и других ионов.

2. Поступающие в клетку протонынейтрализуются благодаря буферной емкости цитоплазмы, которая обеспечивается наличием в цитоплазме нуклеиновых кислот, белков, глутаминовой кислоты, полиаминов. Буферная емкость цитоплазмы возрастает при экстремальных значениях рН. В диапазоне внутриклеточного рН (6-8), характерном для большинства бактерий, буферную емкость среды обеспечивают фосфатные группы в составе РНК и ДНК. При экстремальных значениях рН большую роль играют карбоксильные группы и аминогруппы кислых и основных аминокислот. [Глутамат и полиамины играют роль при экстремальных значениях рН среды. Глутамат защищает клетку от сдвигов рН в кислую сторону.]

Активный рН-гомеостаз обеспечивается транспортом ионов. У нейтрофилов и ацидофилов основными механизмами регуляции рН служат протонные помпы и системы транспорта калия. У ацидофилов в цитоплазме поддерживается рН 6-7. Протонные помпы выкачивают протоны из клетки, что ведет к повышению внутриклеточного рН. При экстремальных значениях рН среды подкислению цитоплазмы препятствует поглощение ионов К⁺ (например, у Thiobacillus thiooxidans), за счет чего внутриклеточная сторона мембраны приобретает (+) и это препятствует входу протонов. Для регуляции рН не существует специальной системы поглощения калия, его вход в клетку обеспечивается главным образом активным выкачиванием протонов протонными помпами (К⁺/Н⁺ - антипорт). [ Регуляция внутриклеточного рН опосредована неизвестной пока сенсорной системой и протондвижущей силой. ]

У алкалофилов рН цитоплазмы составляет 8-8,8 при рН среды от 9 до 11. Основным механизмом поддержания рН-гомеостаза у алкалофилов является работа Nа⁺/Н⁺ - антипорта, который катализирует поступление в клетку протонов, при одновременном выкачивании из нее Na⁺ в процессе дыхания. У алкалофилов ферменты, находящиеся на поверхности клетки или секретируемые в окружающую среду, устойчивы к денатурирующему влиянию щелочной среды. Эти ферменты используются при производстве детергентов.

 

Влияние водной активности на микроорганизмы

Микроорганизмы способны жить и размножаться только в присутствии свободной воды, находящейся главным образом в капельно-жидком виде. Клетки метаболически активных бактерий должны быть окружены водными пленками.

Вода необходима для нормального функционирования клетки. Все биохимические реакции протекают в водной среде. Вода выполняет роль растворителя. Влияет на конформацию макромолекул, принимающих благодаря гидратации необходимую структуру. Обмен веществ между клетками микроорганизмов и средой обычно идет через водные растворы. Вода поддерживает клеточный тургор. [ Для функционирования ферментов в клетке требуется более высокая концентрация растворенных веществ в цитоплазме, чем в окружающей клетку среде. Поэтому в цитоплазме накапливаются растворенные вещества. В клетках большинства бактерий накопление растворенных веществ, в частности ионов, происходит до значительно более высоких концентраций, чем требуется для биосинтетических процессов. Это вызывает поступление в клетку воды и повышение тургорного давления, которое могло бы разорвать мембрану, если бы она не была защищена клеточной стенкой. ].

 

Степень доступности воды для химических реакций и микроорганизмов определяется показателем активности воды а_w.

а_w определяют по формуле:

а_w =Р/Р₀ =ОВ/100 =П₂/(П₁-П₂)

где Р – давление пара в исследуемой системе,

Р₀ – давление пара над дистиллированной водой,

ОВ – относительная влажность воздуха в системе,

П₁ – число молей растворителя,

П₂ – число молей растворенного вещества.

Активность чистой свободной воды равна 1. а_w крови – 0,995. Хотя в природе не бывает химически чистой воды. При взаимодействии воды с поверхностями, анионами, катионами, любыми гидрофильными группами водная активность а_w становится меньше 1.

Водная активность раствора может изменяться двумя путями: осмотическим и матричным.

1. Осмотическое изменение а_w происходит в результате взаимодействия молекул Н₂О с растворенными веществами. При повышении концентрации растворенных веществ значении водной активности снижается. Снижение а_w может происходить за счет:

1) повышения содержания органических веществ (сахаров);

2) повышения содержания солей.

2. Матричное изменение а_w обусловлено адсорбцией молекул Н₂О на поверхностях твердых субстратов. Если влажность субстрата и окружающей атмосферы уравновешена, то а_w адсорбированной воды будет такой же, что и в атмосфере.

В пищевой промышленности и при домашнем консервировании снижение водной активности среды используют для инактивации микроорганизмов. Повышенное содержание солей и сахара используют при консервировании. Высушивание – для получения сухофруктов.

Для хранения микроорганизмов в лабораторных условиях используют лиофилизацию. Это метод быстрого высушивания в условиях ваккума из замороженного состояния (-76°С) в средах специального состава. В таких высушенных клетках биологические процессы резко замедлены. Используют для хранения музейных и производственных штаммов.

 

При повышении осмолярности наружного раствора осмолярность цитоплазмы также должна возрастать, чтобы сохранялся необходимый тургор в клетке. [Осмотическое давление осмолярного р-ра (р-р, содержащий один осмоль вещества в 1 л р-ра) равно 22,4 атм. при 0°С.]. В растворах, имеющих более высокое осмотическое давление, чем внутри микробной клетки, микроорганизмы жить не могут. Это приводит к плазмолизу (т.е. вода выходит из клетки наружу, клетка обезвоживается и протопласт сжимается).

В среде с очень низким осмотическим давлением вода будет поступать внутрь клетки, и это приведет к плазмоптизу (оболочка клетки может лопнуть). [Микроорганизмы, которые могли бы существовать, поддерживая внутри клеток осмолярность более низкую, чем в окружающей среде неизвестны.].

 

Механизм осмотической адаптации у микроорганизмов состоит в том, что постоянство тургора поддерживается путем накопления в клетках веществ – осморегуляторов. Это специфические растворенные вещества, не влияющие на активность ферментов. Обладают высокой растворимостью, способны проникать через клеточную мембрану путем регулируемого транспорта. Способны защищать ферменты от денатурации под действием солей. Эти вещества или синтезируются самой клеткой или попадают в нее из окружающей среды. Это низкомолекулярные соединения – аминокислоты (глутамат, пролин и т.д.), производные аминокислот (бетаин, эктоин), сахара, спирты (глицерин). Уравновешивают внешнее давление. Наиболее эффективные осморегуляторы – бетаин, эктоин, пролин, трегалоза. Среди неорганических осмолитиков важны ионы калия. При этом важна не столько концентрация ионов калия, столько соотношение Na⁺/К⁺, которое поддерживается за счет работы антипорта Nа⁺/Н⁺ - антипорт. Важную роль в осмопротекции играют белки, сходные с БТШ.

 

Микроорганизмы развиваются в диапазоне значений водной активности а_w от 0,99 до 0,6. Большинство микроорганизмов развиваются при а_w ≥ 0,95. Не обнаружено микроорганизмов, растущих при а_w <0,6.

Наиболее приспособлены к росту при низких значения водной активности дрожжи и мицелиальные грибы (а_w 0,65).

Для роста каждого микроорганизма есть оптимальное значение а_w. Если водная активность станет ниже этого уровня в присутствии растворенного вещества, то часть энергии микроорганизм вынужден тратить на осморегуляцию, обеспечение транспортных систем, синтез осмопротекторов. Поэтому в условиях пониженной водной активности происходит уменьшение скорости роста, снижение выхода биомассы. При пониженной водной активности микроорганизм находится в условиях осмотического стресса. Но некоторые микроорганизмы могут достаточно хорошо расти в средах с высокими концентрациями растворенных веществ.

Осмотолерантные называют микроорганизмы, способные переносить достаточно высокие концентрации растворенного вещества, но лучше растущие при более низком осмотическом давлении раствора.

Осмфильными называют микроорганизмы, проявляющие максимальный рост в условиях высокого осмотического давления; они предпочитают развиваться в средах с пониженной водной активностью.

Осмофильными обычно называть микроорганизмы, развивающиеся в средах с высокой концентрацией сахара. Осмофилами являются спироплазмы, они встречаются в нектаре цветов (размножаются). Некоторые дрожжи могут разлагать мед, они растут при концентрации сахара 70-80 %. Однако эти дрожжи не выносят высокой концентрации соли. Мицелиальные грибы и дрожжи обитают в варенье, сиропах, сухофруктах.

Микроорганизмы, растущие в средах с высокой концентрацией солей, называют галофильными (от лат. «halo» - соль). Соленость действует на клетки как осмотический фактор.

Галофильные микроорганизмы подразделяют на умеренные и экстремальные галофилы.

Умеренные галофилы развиваются в диапазоне солености 2-5 – 15 %. Хорошо растут при 10 % NaCl. Не развиваются при низкой концентрации NaCl. Распространены в засоленых почвах, водоемах, соленых продуктах (солонина, разные рассолы, соленые соусы). Встречаются в разных систематических группах: р. Acinetobacter, Alcaligenes, Flafobacterium, Pseudomonas, Vibrio и др. описан специальный род умеренно галофильных бактерий – Halomonas. Механизм осмотической адаптации: синтез в клетках бетаина (осмопротектор), которые связываются с белками, увеличивая их стабильность. К этой группе относят морские бактерии, которые развиваются в диапазоне концентраций соли 2,5 – 5,0 % NaCl. Обитатели морей и океанов.

Экстремальные галофилы развиваются при концентрации солей (NaCl) 12-15 – 32 %. 12-15 % - это нижний предел солености, дальнейшее снижение приводит к лизису клеток. К экстремальным галлофилам относятся архебактерии, входящие в семейство Halobacteriacae. Обитают в гипергалинных водоемах (Мертвое море, где преобладают хлориды магния и кальция), на соленых шкурах животных, на соленой рыбе, на солеварнях. Легко определить по налету красного цвета. Ионы натрия стабилизируют белки клеточных стенок. Имеют белковые или полисахаридные клеточные стенки. Клетки содержат пигменты: каротиноиды и бактериородопсин. В качестве осморегулятора используют ионы калия. В клетках повышенное содержание ионов калия (1000:1), поглощаются из среды – стабилизируют кислые белки, стабилизируют рибосомы.

 

Ксерофильные микроорганизмы

Снижение водной активности среды может происходить за счет матричного водного стресса. Микроорганизмы более чувствительны к матричному водному стрессу, чем к осмотическому.

При влажности выше 94 % на поверхности твердых частиц и клеток м/о формируется пленка гигроскопической воды. Она необходима для нормального функционирования клетки. Большинство бактерий гигрофилы.

Микроорганизмы, развивающиеся в условиях сухости субстрата называются ксерофильными.

Они встречаются на поверхности скал, почвы, коре деревьев, поверхности листьев (эти субстраты увлажняются лишь периодически), в почвах пустынь и полупустынь. Например, в почвах Сахары обнаружены десятки видов микроорганизмов, их количество 10³ – 10⁸ кл/г. Здесь доминируют водоросли, обеспечивающие формирование этих почв, грибы, актиномицеты, бактерий меньше.

Наиболее приспособлены к сухости среды грибы и актиномицеты. Из бактерий более устойчивы кокковидные формы. Бактерии формируют капсулы при высушивании, переходят в покоящиеся стадии - образуют споры и цисты. Неспорообразующие бактерии переходят в состоянии анабиоза.

Еще один механизм ксерофилии – это использование экзогенной воды.

При дефиците влаги микроорганизмы не размножаются. В высушенных пищевых продуктах (рыба, мясо, фрукты) м/о сохраняются, но не размножаются. При их увлажнении – интенсивное размножение, что вызывает порчу.

Устойчивые к высушиванию патогенные бактерии: микобактерии за счет толстой клеточной стенки, содержащей большое количество липидов. Сальмонеллы могу сохраняться в комнатной пыли в течение 3 мес., в сухом кале КРС до 4 лет.