Измерение тепловыделения микроорганизмов в водной среде и почве

Для анализа микроорганизмов широко используются методы культивирования клеток в питательном агаре и других питательных средах. Помимо длительности и трудоемкости анализа, данные методы не позволяют охарактеризовать активность микроорганизмов, а также анализировать не растущие и не культивируемые формы клеток.

Микрокалориметрия – один из немногих универсальных методов анализа, который позволяет определять физиологическую и биохимическую активность клеток.

В данной работе были проведены исследования по тепловыделению микроорганизмов почвы при помощи специального прибора – микрокалориметра МКМ-Ц.

Измерение теплопродукции клеток проводили на микрокалориметре МКМ-Ц. В 1 г почвы с микроорганизмами вносили 0,2 мл воды (контрольная проба), после измерения в нее вносили 0,2 мл 0,5 % биоцида В ячейку сравнения помещали дистиллированную воду и регистрировали кинетику тепловыделения микроорганизмов.

Результаты измерений обрабатывали статистически, используя программное обеспечение Microsoft Excel.

О влиянии тепловыделении микроорганизмов судили по изменению относительного уровня тепловыделения клеток (q/q_о), времени задержки роста тепловыделения (t_о), удельной скорости тепловыделения (μ = (1/q)·dq/dt), где q и q_о – мощности теплопродукции микроорганизмов в рабочей и контрольной пробах, соответственно.

С увеличением времени культивирования клеток отмечается возрастание тепловыделения образцов, связанное с ростом численности микроорганизмов.

Схема прибора микрокалориметра приведена на рисунке 16. Микрокалориметр состоит из трех функциональных блоков: ТБ – термоблок (I), БПР – блок питания и регулирования (II), БИ – блок индикации (III).

Термоблок обеспечивает термоизоляцию, термостатирование кювет с пробами, теплосъем тепловых потоков.

Блок питания и регулирования предназначен для питания и регулирования всех блоков прибора и задания температурного режима работы.

Блок индикации обеспечивает: выбор режимов измерения, подачу калибровочной мощности в ячейки микрокалориметра, усиление и преобразование сигналов с тепломеров в цифровую форму, автоматическую калибровку и обработку результатов измерений, ввод необходимых констант в память прибора, вывод результатов измерений на табло и их запоминание.

Технические характеристики микрокалориметра МКМ–Ц:

– диапазон измерения теплового потока, мкВт – 10¹–10⁴

– предел абсолютной допускаемой погрешности измерения теплового потока, мкВт – ±18

– диапазон регулирования температуры,ºС – 30–50

– рабочий объем кювет, см³ – 3±0,5.

Все живые организмы в процессе жизнедеятельности преобразуют энергию, заключенную в химических связях питательных веществ, в универсальные источники энергии и используют их для синтеза биомассы и выполнения других жизненно важных функций. При этом часть энергии превращается в тепло, которое рассеивается в окружающей среде.

 

Рисунок 16 – Общий вид микрокалориметра МКМ –Ц:

 

I – термоблок: 1 – канал А с рабочей кюветой; 2 – канал Б с контрольной кюветой; 3 – лоток для сбора промывной жидкости; 4 – станина; II – блок индикации: 5 – индикаторное табло показаний измерений; 6 – табло вольтметра; 7 – кнопка «Установка»;8 – кновка «Выбор»; 9 – кнопка «Запись»; 10 – кнопка вызова показаний из памяти микропроцессора и возвращение в режим измерения; 11 – панель показателей измерений: Q – мощность теплового потока (мкВт), N – число клеток (млн.кл/см³), D – скорость изменения мощности теплового потока (мв/ч), V –скорость роста клеток (млн. кл/см³*ч), S – количество выделенного тепла (мДж), B – показания базовой линии, T – время с начала эксперимента (с), E – калибровочное число (В/Вт); 12 – панель режимов измерений: В – запись базовой линии, Е – калибровка, кнопка «S=0» – начало измерений; III – блок питания и регулирования: 13 – тумблер «Сеть»; 14, 15, 17, 19, 20 – светодиоды включения в сеть, работы микропроцессора, термостатирования, сигнализации перегрева соответственно; 16, 18 – тумблеры грубой и точной установки температуры.

Рассмотрим более подробно принцип работы и подготовку микрокалориметра к работе.

1.Принцип работы прибора и его назначение

Микрокалориметр МКМ – Ц предназначен для определения общей бактериальной обсемененности молока и молочных продуктов, но может быть также использован и для микробиологического анализа других пищевых продуктов. С его помощью можно изучать физиологическую активность и содержание микроорганизмов в биотехнологических, микробиологических и биоэкологических исследованиях.

Все живые организмы в процессе жизнедеятельности преобразуют энергию, заключенную в химических связях питательных веществ, в универсальные источники энергии и используют их для синтеза биомассы и выполнения других жизненно важных функций. При этом часть энергии превращается в тепло, которое рассеивается в окружающей среде.

Величина выделяемого микроорганизмами тепла зависит от количества клеток. Их вида, особенностей метаболизма и их физиологической активности. При внесении исследуемых проб с живыми микроорганизмами в микрокалориметр выделяемое клетками тепло передается через теплопроводящую стенку кюветы к тепломерам микрокалориметра, а также частично рассеивается в окружающую среду. Так как скорость тепловыделения микроорганизмов значительно ниже скорости распространения тепла к тепломерам. То через определенное время устанавливается термодинамическое равновесие. Количество тепла, регистрируемое микрокалориметром, пропорционально количеству микроорганизмов и их физиологической активности.

3. Отбор и подготовка проб к измерению

Для анализа брали пробу земли массой 1 г, к ней добавляли 0,2 мл 0,5 % раствора дизенфицирующего средства. Контрольной пробой являлась земля, массой 1 г и 0,2 мл воды.

Далее анализ производили с надосадочной жидкость, которая распологалась над землей в пробирки. Для анализа брали 1 мл надосадочной жидкости и вносили в нее 0,2 мл воды – контрольная проба. Вторая пара состояла из 1 мл надосадочной жидкости и 0,2 мл 0,5 % раствора Инкрасепт (10 % полигексаметиленгуанидин гидрохлорид).

4.Подготовка прибора к работе

Для подготовки прибора к работе необходимо включить тумблер «Сеть», установить тумблер «Температура» в положение 30⁰С. Вставить рабочие кюветы в микрокалориметр и прогреть прибор в течение 1 ч. О выходе прибора на температурный режим измерения указывает загорание светодиода «Статирование». Последовательным нажатием клавиш «Установка» и «Выбор» вводят в память микрокалориметра рабочие константы: С – время подачи звукового сигнала – от 10 до 200 мин; U – время автоматической записи измеряемых величин в память микропроцессора – от 1 до 99 мин; F – среднее значение физиологической активности микроорганизмов – от 1 до 999 мкВт/см³*Кл; Е – калибровочное число, определяемое при калибровке прибора и находящееся в диапозоне 1070 – 1400 мкВт/мВ.

После термовыравнивания кювет проводится запись базовой линии микрокалориметра нажатием клавиши «Режим В». Базовая линия автоматически записывается в память прибора и используется в качестве нулевого показания.

Микрокалориметр считается вышедшим на рабочий режим измерения, если при повторной записи базовой линии ее смещение не превышает 5 мкВт за 10 мин.

5. Калибровка микрокалориметра МКМ – Ц

Калибровка микрокалориметра проводится с целью определения калибровочного числа Е и выполняется не реже 1 раза в месяц.

Для выполнения калибровки в микрокалориметр устанавливаются калибровочные кюветы и после выхода прибора на рабочий режим нажатием клавиши «Режим В» записывается базовая линия прибора. Затем нажатием клавиши «Режим Е» через одну из калибровочных кювет пропускается электрический ток от встроенного источника тока. Через 10 мин прибор автоматически рассчитывает калибровочное число и высвечивает его на индикаторном табло при нажатии клавиши «Е».

6. Проведение измерений

При выполнении измерений необходимо вначале записать показание базовой линии прибора для изучаемых образцов. Для этого в рабочий и контрольный канал микрокалориметра устанавливаются проточные кюветы и в них заправляется по 1 см³ контрольной пробы с подавленным метаболизмом микроорганизмов. Пробы выдерживают в микрокалориметре 20 мин. После нажатия клавиши «Режим В» показание базовой лини прибора автоматически вносится в память микропроцессора.

На втором этапе измерений из рабочего канала микрокалориметра выливается контрольная проба и в кювету заправляется рабочая проба объемом 1 см³ с активной микрофлорой. После нажатия клавиши «Режим S» в течении 20 мин проводятся измерения теплопродукции клеток в рабочем образце. По окончании измерения микрокалориметр подает звуковой сигнал и записывает показания в память прибора. После нажатия клавиш «Q» и «S» на панели показателей на индикаторном табло соответственно высвечиваются измеренные значения мощности теплового потока и количества выделенного тепла для анализируемой микрофлоры.

 

Результаты и их обсуждения