Скорость адаптации и дезадаптации микроорганизмов

Кинетика роста бактериальной популяции не устанавливается кинетикой роста индивидуальной клетки, хотя между ними, несомненно, существует взаимосвязь. Скорость увеличения объема индивидуальной клетки можно рассматривать как функцию времени, которое позволяет объему клетки удвоиться к концу периода между делениями. Между скоростью роста и размером клеток существуют определенные математические отношения.

Для количественной характеристики ростовых процессов в микробной популяции пользуются двумя показателями: абсолютной (валовой) скоростью и относительной (удельной) скоростью роста.

Между временем генерации (продолжительностью жизни одного поколения) и удельной скоростью роста существует обратно пропорциональная зависимость. Скорость роста микробной популяции не является величиной неизменной.

В развитии микробной популяции различают следующие последовательные стадии: лагфаза; фаза положительного ускорения; фаза логарифмического роста; фаза отрицательного ускорения; стационарная фаза; фаза ускоренной гибели; фаза логарифмической гибели и фаза уменьшения скорости отмирания. Они отражают сложные процессы адаптации бактерий, привнесенных из одной среды обитания в другую, как правило, оптимальную для их размножения. Природа лагфазы во многом связана с тем, что в этот период происходит активный синтез всех компонентов белоксинтезирующей системы и прежде всего такого количества рибосом, которое позволило бы обеспечить максимальную активность всех биосинтетических процессов.

Последующие стадии развития периодических культур отражают высокую скорость размножения бактерий. Затем, в силу постепенного истощения источника энергии и других жизненно важных метаболитов, скорость размножения бактерий уменьшается, и в стационарной фазе наступает период некоторого равновесия — количество вновь образующихся клеток становится сопоставимым с числом погибающих клеток.

Вслед за этим наступает стадия, характеризующаяся постепенным уменьшением количества жизнеспособных бактерий. Это является следствием ряда причин — истощения источников энергии и других жизненно важных метаболитов, невозможности эффективно регулировать рН среды, накопления продуктов метаболизма, тормозящих рост, и, возможно, каких-то других факторов. Очевидно, что популяция бактерий — это тоже саморегулирующаяся система, очень зависящая от среды, истощение которой оказывает на нее отрицательное действие. Жизнеспособные клетки, перенесенные из такой среды в новую питательную среду, вновь повторяют полностью весь цикл развития популяции.

 

Методы контроля адаптации и дезадаптации микроорганизмов к среде

Существуют следующие группы методов адаптации и дезадаптации микроорганизмов к среде:

Микробиологические методы.

Оптическую плотность (ОП) - светорассеяние клеточной суспензии можно измерить нефелометрически (λ=540, 600 или 650 нм, l=10 мм).

Массу сухих клеток (МСК) можно определять после их высушивания до посто-янной массы в течение 24 часов при температуре 105 ⁰С.

Жизнеспособность клеток можно определить по количеству колониеобразующих единиц (КОЕ) при высеве клеточных суспензий из ряда десятичных разведений на агаризованные среды.

Термоустойчивость клеток определяют после прогрева клеточных суспензий в ультратермостате «UV-10» при соответствующих температурах в течение определённого времени с последующим определением числа КОЕ.

Радиоустойчивость клеток определяют по сохранению ими жизнеспособности (КОЕ) через 30 мин и 2 часа после γ-облучения интенсивностью 194 рад/с (установка ГУРХ 100000, γ-60Со).

Устойчивость дрожжей к синглетному кислороду (1О2) определяют в клетках, фото-сенсибилизированных хлорином е6, при их облучении монохроматическим лазером с λ=662 нм (20 мВт/см2) с последующим определением числа КОЕ.

Устойчивость к антибиотикам бактерий определяют, рассчитывая индекс ингибирования роста культуры IE=(1-ΔОПопыт/ΔОПконтр)х100.

Микроскопические наблюдения проводят в микроскопе «Amplival» (Германия) с фазово-контрастным устройством.

Скорости роста и иные показатели роста бактериальных культур при изучении действия адаптогенов можно определять по:

1) динамике светорассеяния их культур (λ=540, 600 или 650 нм - ОП540, ОП600, ОП650, КФК-2, КФК-56М, PyeUnicam);

2) численности колониеобразующих единиц (КОЕ) при высеве аликвот культур на плотные среды (МПА, сусло-агар и др.);

3) интенсив-ности дыхания (выделению СО2), (ИК-анализатор «Инфралит», Германия).

2) Биохимические и физико-химические методы. В качестве химических ана-логов микробных АОБ можно использовать алкилрезорцины С7-АОБ (5-метилрезорцин) и С12-АОБ (4-гексилрезорцин) (99% чистоты, синтезированные в МГУТХТ). Соединения необходимо внести в реакционные среды в виде раствора в этаноле или в виде водорастворимых К-солей.

Концентрацию АОБ в образцах можно определить с помощью колориметрической реакции с диазониевым производным 3,3’-диметоксибензидина (реактивом Fast Blue B Salt diazotized (FBB), Sigma) [Tluscik et al., 1981].

Количество белка определяют колориметрически по методу Лоури [Lowry et al., 1951] или в реакции с Кумаси синим (Fluka) [Bradford, 1976].

Активность трипсина (Sigma) можно определять модифицированным методом Ансона [Грачева с соавт., 1982]. Значения Кm и Vmax трипсина определяли из зависимостей Лайнуивера-Бэрка.

Активность α- и β-амилаз (Fluka) определяются по количеству образующихся при гидролизе крахмала редуцирующих веществ с 3,5-динитросалициловой ки-слотой (Fluka) [Грачева с соавт., 1982; Miller, 1959].

Вязкость растворов белков можно определить вискозиметрическим методом [Алейникова, Рубцова, 1988].

Степень набухания белка можно определить по модифицированной методике [Зимон, Лещенко, 2001].

Гель-фильтрацию растворов белков можно проводить на колонке (35,0х2,5 см), заполненной сефадексом G-75 (Chemapol).

Продукты окисления АОБ определяются методом хроматомассспектрометрии (ХМС) на масс-спектрометре модели 5973 с газовым хроматографом модели 6890 (Hewlett Packrd, США), для детекции свободных радикалов можно использовать ЭПР-спектрометр (ЭПР-спектрометр ESR 70-03 XD/2, Bruker BioSpin). Для идентификации разделенных веществ так же можно использовать спектральные библиотеки NIST98 и Wiley275.

О физико-химических свойствах микробных адаптогенов можно судить по сохранению/потере ими биологической активности после:

1) инкубации при рН 1 или 11;

2) прогревания (100оС, 20 мин;

3) инкубации с протеиназой К (иммобилизованной на стекле, BDH, UK)(0,2 мг/мл, 2 ч, 30оС); 4) адсорбции на гидрофобном носителе (картридж Sep-Pak C18, Millipore, UK) с последующей элюцией метанолом.

Молекулярную массу адаптогенов можно оценить методом ультрафильтрации (фильтр Centriplus с мембраной YM Millipore, UK, для молекул с М=3-10 кДа или в камере типа "Amicon", Россия, с мембранами Diaflo РМ-10, с порогом отсечения молекул с М<10 кДа).

Антиоксидантную активность АОБ можно определить по реакции обесцвечивания красителя дихлорфенолиндофенолята натрия в присутствии препаратов, а также на приборе «Цвет Яуза-01-АА».

Молекулярную динамику лизоцима, модифицированного С7-АОБ и С12-АОБ, можно исследовать методами Рэлеевского рассеяния Мёссбауэровского излучения (РРМИ), диффузного рассеяния рентгеновских лучей (ДРРЛ) и молекулярно-динамического компьютерного моделирования (МДКМ) (в лаборатории молеку-лярной динамики ИХФ им. Н.Н. Семёнова РАН, д.ф.н., проф. Ю.Ф. Крупянский).

3) Генетические методы. Генотоксическое (мутагенное) или антимутагенное действие алкилоксибензолов можно выявить в стандартном тесте без метаболической активации [Maron, Ames, 1983] с ауксотрофным по триптофану штаммом В1733 Bacillus subtilis trpA5. Предварительно оценить рост-ингибирующую активность алкилоксибензолов (С7-, С12-АОБ) по их влиянию на развитие этого штамма.

Для исследования влияния АОБ на активность стрессовых генов SOS-ответа (umuD) и rpoS -регулона (osmE) можно получить тестерные штаммы на основе E.coli c600 thi, thr, leu Δ pro-lac со встроенной малокопийной плазмидой pJEL246, несущей гибридные опероны umuD::lacZ и osmE::lacZ (во ВНИИГенетика, д.б.н., проф. А.С. Миронов). Об уровне экспрессии стрессовых генов можно судить по активности β-галактозидазы, которую можно определить по расщеплению субстрата (о-нитрофенил-β-галактопиранозида) [Грачёва, 2005].

4) Методы идентификации микробных антиадгезинов. Антиадгезин P.fluorescens можно получить твердофазной экстракцией культуральной жидкости на колонке с гидрофобным сорбентом (Sep-Pak C18, Millipore) и идентифицировали методом хромато-масс-спектрометрии на хроматографе 6890 и масс-спектрометре 5973 (Hewlett Packard) с использованием спектральных библиотек Willey275 и NIST98 по программе ChemStation (Hewlett Packard).

Антиадгезины B.licheniformis можно получить методами колоночной хроматографии на силикагеле L100/160 (Lachema, Czech Republic) и тонкослойной хроматографии на пластинах с силикагелем (Merck, Germany) с выявлением аминной, амидной, эфирной, диольной, фосфатной групп [Vaskovsky, Latyshev, 1975; Kates, 1986]. Состав жирных кислот можно определить методом ХМС [Batrakov et al., 2003]. Аминокислотный состав определяется методами ТСХ и ХМС. ИК-спектры снимали на спектрометре Specord 71 (Carl Zeiss, Germany), в таблетках KBr. Спектры 13С-ЯМР получали на установке Unity Plus instrument (Varian, USA) [Batrakov et al., 2003].

5) Биотесты для обнаружения ВА. Для выявления ВА, влияющих на рост мик-роорганизмов, в тест-культуры опытных вариантов фазы экспоненциального роста необходимо внести культуральные жидкости (КЖ) (до 50% об.) от культур, подвергшихся действию стрессора (тетрациклин, окислитель N-этилмалеимид (NEM), выдерживание при 44-50 ⁰С или 5-15 ⁰С в течение 1 ч) или от культур, растущих в обычных, не стрессовых, условиях – контрольные варианты. КЖ можно получить, отделяя клетки центрифугированием и мембранной фильтрацией (Ø пор 0.2 мкм). О наличии ВА судят по изменению скорости роста или по уменьшению лаг-периода опытных и контрольных культур, растущих в стрессовых или стандартных условиях, соответственно.