Методи виділення чистих культур мікроорганізмів

 

Сукупність життєздатних мікроорганізмів, вирощених на певному поживному середовищі, називається культурою мікроорганізмів, а сам процес вирощування - культивуванням. Чиста культура мікроорганізмів представляє собою популяцію мікроорганізмів одного виду, що виросла на стерильному поживному середовищі. Вид – таксономічна категорія, що об'єднує групу мікроорганізмів спільного походження, близьких за своїми властивостями, відокремлену відбором від інших видів і пристосовану до певної середовищі існування. Культуру, що складається з різних видів мікроорганізмів, називають змішаною культурою. У біотехнології застосовують високопродуктивні штами мікроорганізмів.
Штамом називають чисту культуру мікроорганізмів, виділених з певного джерела, тобто з середовища їх проживання, і відрізняються деякими спадковими властивостями від інших представників виду. Штам являє собою генетично однорідну культуру, яку штучно підтримують за допомогою відбору спадково однорідних клітин.

У реальних умовах одночасно співіснують різні види мікроорганізмів. З природного середовища існування мікроорганізми переносяться в спеціальні середовища, умови в яких будуть сприятливі тільки для певного виду мікроорганізмів і несприятливі для супутніх видів. Такі поживні середовища називають елективними.

Елективні умови можна створювати, змінюючи склад середовища, значення рН, температуру і т.і. Наприклад, дріжджі виділяють, використовуючи кислі середовища (рН 3,5...5,0) або середовища, збагачені вуглеводами (масова частка цукрів 20...50%). У елективному поживному середовищі відбувається накопичення певного виду мікроорганізмів і пригничення життєдіяльності супутніх видів. Отримані культури називають накопичувальними.

З накопичувальної культури виділяють чисту культуру мікроорганізмів, використовуючи методи, що засновані або на біологічних властивостях мікроорганізмів, або на принципі механічного їх поділу. Практично виділення чистої культури зводиться до ізоляції однієї клітини і отримання чистої культури у вигляді потомства цієї батьківської клітини. Генетично однорідне потомство однієї клітини називається клоном.
Таким чином, отримання чистої культури мікроорганізмів та її використання включає три етапи: отримання накопичувальної культури, виділення чистої культури і контроль чистоти культури.

Для придбання навичок роботи з мікроорганізмами використовуються окремі види дріжджів. Термін "дріжджі" не має самостійного таксономічного значення. Дріжджами називають грибні організми, які проводять більшу частину свого життєвого циклу у вигляді окремих клітин. Отже, дріжджі можуть бути визначені як одноклітинні гриби, що розмножуються брунькуванням або поділом. Однак, як представники вищих грибів, вони можуть утворювати міцелій і розмножуватися спорами, в тому числі і статевим способом.

Дріжджі більш зручний об'єкт для дослідження, ніж інші мікроорганізми. Клітини дріжджів досить великі, мають круглу, овальну або подовжену форму, з максимальними розмірами від декількох мікрометрів до 15-25 мкм і більше. Дріжджі не токсичні і не патогенні для людини і з найдавніших часів використовуються в якості біологічного агента для виробництва харчових продуктів.

Аскоспорогенні дріжджі, що входять до родини Saccharomyces (сахароміцети) і Schizosaccharomyces (шизосахароміцетів), широко використовуються в харчовій промисловості і, в якості продуцентів етанолу, в гідролізний промисловості та на сульфітно-спиртових заводах. Дріжджі, що відносяться до недосконалих грибів, серед яких виділяються представники роду Candida, використовують для виробництва білкової біомаси, так як в дріжджових клітинах міститься багато білка, вуглеводів, амінокислот і вітамінів групи В. Окремі види дріжджів вирощують не тільки на вуглеводному сировині, але і на вуглеводневому.

Допоміжні операції

Пересівання мікроорганізмів

У мікробіологічної практиці постійно зустрічається необхідність перевести культуру мікроорганізмів з однієї судини в іншій. Така операція називається пересів мікроорганізмів. Пересівання роблять при виділенні чистої культури мікроорганізму, при необхідності розмножити мікроорганізми, при вивченні мікрофлори об'єктів і для освіження старої культури (рис. 6).

Пересівання мікроорганізмів слід проводити в асептичних умовах в приміщенні з чистим повітрям, краще у відгородженої частині кімнати (заскленому боксі), при найменшому русі повітря. Стіл повинен бути чистим, попередньо протертим змоченим у спирті ватним тампоном. Перед роботою необхідно ретельно вимити руки, одягнути халат.

 

 

Рис. 6. Посів культури з пробірки у пробірку

Посів культури проводиться над полум'ям спиртового пальника в умовах, що забезпечують найменшу можливість попадання сторонньої мікрофлори в поживне середовище, що засівають.

Посів проводиться бактеріальної платинової або хромонікелевої петлею, що впаяна в скляну паличку або укріплена в спеціальному тримачі. При посіві бактеріальна петля береться у праву руку за держатель, затискається між великим і вказівним пальцями і стерилізується прожаренням на полум'ї пальника (рис. 6,а). Після розжарювання докрасна петлі обпалюється весь дротик і частина утримувача, що дотикається до нею. Потім в ліву руку беруть дві пробірки (одна з культурою дріжджів, яка служить посівним матеріалом, а інша зі скошеним поживним середовищем). Пробірки тримають в похилому положенні. Мізинцем і безіменним пальцем правої руки захоплюють пробки пробірок і притискають до долоні правої ж руки; ліва рука робить обережні обертальні рухи, а права виймає пробки над полум'ям (рис. 6,б). При такому обережному витяганні пробок повинно виключатися різке входження навколишнього повітря у пробірки, що відкриваються, а разом з ним і сторонніх мікроорганізмів. Всю цю операцію проводять швидко, продовжуючи тримати в правій руці обпалену бактеріальну петлю, не торкаючись нею будь-яких предметів.
Після вилучення пробок горловини пробірок відразу ж обпалюють по колу на полум'ї пальника, потім вводять в пробірку з культурою петлю і охолоджують її, торкаючись до внутрішньої поверхні судини, після чого петлею підхоплюють шматочок або краплину посівного матеріалу (рис. 6,в).
Відібраний посівний матеріал бактеріальної петлею переносять в пробірку зі стерильним поживним середовищем (рис. 6,г). Обидві пробірки закривають над полум'ям пальника пробками (рис. 5,д). Після посіву бактеріальну петлю обов'язково обпалюють (рис. 6,е).

При пересіванні мікроорганізмів, що знаходяться у вигляді суспензії в рідкому середовищі, крім бактеріальної петлі використовують градуйовані піпетки і піпетки Пастера. Піпетки повинні бути стерильними, загорнутими у папір. При розгортанні паперу і наступних операціях не можна чіпати руками нижню частину піпетки і торкатися нею до сторонніх предметів. Робота з посівним матеріалом проводиться з дотриманням тих же правил, що і при роботі з бактеріальною петлею. Використані піпетки поміщають у дезінфікуючий розчин і повторно використовують тільки після стерилізації.

У мікробіологічної практиці для кількісних вимірювань часто працюють з суспензіями мікроорганізмів. В якості суспензійних рідин використовують стерильну водопровідну воду. Змішуючи суспензію мікроорганізмів з певним обсягом води, можна добитися необхідного розведення. Висів на щільні середовища з підготовленою суспензії роблять піпеткою, вносячи в кожну чашку із середовищем по 0,05 см³ або по одній краплі виміряного об'єму. Для кожного розведення висів здійснюють не менше ніж у три чашки, і результати вимірювань потім усереднюють.