Приготування постійних (фіксованих) препаратів

Приготування постійних препаратів мікроорганізмів починають з отримання мазка, для чого на поверхні предметного скла бактеріальної голкою розподіляють (розтирають) тонким шаром по площі 2...4 см² краплю суспензії досліджуваної культури. Занадто розтирати краплю не слід, тому що при цьому порушується природне взаєморозташування клітин мікроорганізмів. Мазок висушують на повітрі і фіксують. У процесі фіксації мікроорганізми гинуть і фіксуються на поверхні предметного скла, що захищає їх від змивання при фарбуванні. Крім того, убиті мікроорганізми краще сприймають барвники, ніж живі.

Фіксацію здійснюють фізичними і хімічними методами. У фізичному методі фіксація повністю висушеного мазка відбувається над полум'ям спиртівки протягом декількох секунд. Для цього кінець предметного скла мазком догори захоплюють за межі великим і вказівним пальцями і проводять скло 3...4 рази через верхню частину полум'я спиртівки. При термічній фіксації можливі незворотні зміни в будові клітини, тому фіксацію проводять швидко, не допускаючи перегріву предметного скла. Тим не менш, при вивченні будови клітини цей метод фіксації не використовують.

У хімічному методі фіксації предметне скло з мазком занурюють у фіксуючу рідину або наносять її на поверхню мазка. Час обробки залежить від використовуваного фіксатора: 10...15 хв. – етанол, спірто-ефірна (1:1) суміш, 5 хв. – ацетон, суміш Флемінга (75 см³ 1%- ї хромової кислоти, 20 см^з 2%-ї осмієвої кислоти і 5 см³ 75%-ї оцтової кислоти), 3 хв. – метанол, кілька секунд – формалін, пари осмієвої кислоти. Зазвичай при фіксації етанолом або спірто-ефірною сумішшю кілька крапель фіксатора піпеткою або з крапельниці наносять на поверхню препарату і залишають до повного випаровування фіксатора. Після фіксації препарат промивають водою і забарвлюють.

 

Фарбування препаратів

Забарвлення фіксованого препарату проводиться простими і складними методами. Простим методом забарвлення називають забарвлення препарату яким-небудь одним барвником. У складних методах фарбування проводять в декілька стадій різними барвниками. Складні методи забарвлення дозволяють вивчати структуру клітини і провести диференціацію мікроорганізмів.

У простих методах використовують барвники анілінового ряду (основні або кислотні). Для фарбування мікроорганізмів зазвичай використовують основні барвники (генціановий фіолетовий, кристалічний фіолетовий, метиленовий синій, основний фуксин), які більш інтенсивно їх фарбують у порівнянні з кислими барвниками (еритрозин, еозин, кислий фуксин). Барвники випускаються у вигляді аморфних або кристалічних порошків, з яких спочатку готують насичені спиртові розчини, а з них – ввідно-спиртові, які і використовують для фарбування.

Мікроорганізми фарбують, наносячи на певний час розчин барвника на поверхню фіксованого препарату. Наприклад, забарвлення основним фуксином ведуть 2 хв., метиленовим синім – 5...7 хв. Якщо необхідне тривале фарбування, то розчин барвника наливають у чашку Петрі, в неї поміщають предметні скла препаратами вниз на підкладені скляні палички і закривають кришкою. Після закінчення необхідного часу барвник зливають з предметного скла і промивають препарат водою до безбарвної промивної води, що стікає з поверхні скла. Потім препарат висушують на повітрі або обережно осушують фільтрувальним папером. Якщо препарат правильно пофарбований і добре промитий, то в полі зору мікроскопа він буде абсолютно прозорим з інтенсивно забарвленими клітинами.

Забарвлення за Грамом (модифікація Синьова). Згідно з методом, запропонованим Грамом в 1884 р, всі мікроорганізми поділяють на грампозитивні і грамнегативні. Забарвлення за цим методом проводять смужками фільтрувального паперу, попередньо просоченими 1%-м розчином генціанового, або кристалічного фіолетового і висушеними. На фіксований препарат накладають забарвлений папір і заливають невеликою кількістю води. Барвник розчиняється у воді і забарвлює при цьому препарат. Через 2 хв. папір видаляють пінцетом, зливають розчин барвника (але не змивають) і наносять розчин Люголя. Через 30-60 с після почорніння препарату розчин зливають, і предметне скло занурюють в етанол на 20...30 с. Знебарвлення спиртом здійснюють до зникнення фіолетових струменів фарби, після чого препарат ретельно промивають водою. Потім протягом 2 хв. забарвлюють препарат водним фуксином і промивають водою до знебарвлення промивної води.

Препарат висушують фільтрувальним папером. У грампозитивних мікроорганізмів комплекс йоду з основним фіолетовим барвником, що утворився в клітинній стінці при обробці спиртом, не вимивається і вони зберігають синьо-фіолетове забарвлення. Грамнегативні мікроорганізми при обробці спиртом знебарвлюються і легко забарвлюються фуксином в світло-червоний колір.

Дослідження мікрофлори молочних продуктів. Готують бактеріальної петлею мазки молочних продуктів (кефір, сметана, кисляк і т.і.) на предметних стеклах. Якщо досліджуваний продукт густий, то на скло попередньо наносять краплю стерильної води, в якій і розводять продукт. Мазок висушують при кімнатній температурі і фіксують спірто-ефірною сумішшю, для чого на мазок піпеткою наносять фіксатор на 5...7 хв. Спірто-ефірна суміш, крім фіксації, розчиняє жири, що заважають мікроскопічному дослідженню бактерій, що містяться в молочних продуктах. Фіксовані препарати забарвлюють метиленовим синім протягом 7...10 хв. Препарат підсушують і переглядають під мікроскопом з імерсійним об'єктивом (див. далі). Бактерії Streptococcus lactis (молочнокислі стрептококи) представляють собою кулясті клітини діаметром 0,5...1,0 мкм, розташовані попарно короткими або довгими ланцюжками. Бактерії Lactobacillus bulgaricus (болгарська ацидофілінова паличка) мають палочкоподібні клітини довжиною 4...5 мкм, розташовані окремо або короткими ланцюжками.

Забарвлення за методом Ціля-Нільсена застосовується для фарбування кислотостійких мікроорганізмів, які не офарблюються іншими методами, а також для виявлення спор. Для цього використовують контрастне фарбування, при якому спочатку повністю фарбують препарат, в тому числі і спори. Потім препарат частково знебарвлюють. При цьому спори, сильніше утримують барвник, залишаються пофарбованими, а цитоплазма знебарвлюється. Далі іншим барвником підфарбовують цитоплазму, створюючи колірний фон, на якому добре проглядаються пофарбовані в інший колір спори.

При фарбуванні за методом Ціля-Нільсена фіксований препарат покривають смужкою фільтрувального паперу, на яку наливають карболовий фуксин Ціля. Потім, тримаючи препарат пінцетом, нагрівають його над полум'ям спиртівки до появи парів. Додають нову порцію барвника і повторюють операцію протягом 3...5 хв. Далі видаляють фільтрувальний папір і охолоджують препарат до кімнатної температури, після чого ретельно промивають водою. Препарат знебарвлюють 5%-м розчином сірчаної кислоти, опускаючи предметне скло на 20...30 с в кислоту, і потім препарат ретельно промивають водою. Далі препарат протягом 5 хв. забарвлюють спіртоводним розчином метиленового синього, знову промивають водою і висушують. В результаті спори забарвлюються в червоний колір, а самі клітини в синій.

В одній з модифікацій цього методу на фіксований препарат наливають карболовий фуксин так, щоб весь мазок був покритий фарбою. Препарат повільно (2...5 хв.) нагрівають на полум'ї пальника до появи парів, при цьому фарбі не дають підсохнути, підливаючи нові порції фарби. Потім фарба змивається водою і знебарвлюється 95%-м етанолом, який містить 1 об. % концентрованої соляної кислоти. Препарат промивають водою і дофарбовують 3...5 хв. l%-м розчином метиленового синього.

Наявність спор в дріжджових клітинах можна встановити при розгляданні й незафарбованого препарату. При цьому вони будуть виглядати як сильно заломлюючі світло одноманітні за розмірами і формою (круглі або овальні) тільця, що містяться всередині клітин. При звичайних методах фарбування ці тільця залишаються незабарвленими.

Забарвлення за методом Віртца. Фіксований препарат дріжджових клітин заливають 5%-м водним розчином малахітового зеленого і 3...4 рази прогрівають над полум'ям спиртівки до появи парів (30...50 с). Фарбування можна робити, витримуючи препарат 3...5 хв. у розчині барвника при 80°С. Після фарбування препарати промивають водою і дофарбовують 30 с 0,5%-м водним розчином сафраніна. В результаті спори фарбуються в синьо-зелений, а клітини в червоний колір.

Фізіологічний стан дріжджових клітин при культивуванні на різних поживних середовищах можна оцінювати за наявністю включень волютину, глікогену і жиру. У молодих активно зростаючих дріжджових клітинах міститься багато волютину, який є не тільки резервною речовиною, але й бере участь у процесах спороутворення і вегетативного розмноження. Волютин зустрічається в клітинах у формі напіврідких зерен різної величини і складається з поліфосфатів, ліпопротеїдів, РНК та катіонів магнію. Накопичення волютину відбувається в середовищах, багатих сполуками фосфору. Глікоген – резервний полісахарид, масова частка якого в дріжджових клітинах може досягати в окремі періоди 30%. Жир також відноситься до резервних речовин. Включення жиру зустрічаються в клітинах багатьох мікроорганізмів, у тому числі і дріжджів. У цитоплазмі молодих дріжджових клітин включення жиру дуже дрібні, тоді як у більш зрілих і старих клітинах вони коалесцірують (злипаються) у великі краплі.

Фарбування включень волютину метиленовим синім. Фіксований препарат дріжджових клітин забарвлюють 3 хв. метиленовим синім і промивають водою. Зерна волютину при цьому забарвлюються у фіолетовий колір, а цитоплазма в блакитний. Для контрастування препарату або знебарвлюють цитоплазму обробкою 1%-м розчином сірчаної кислоти протягом 15...20 с з наступним швидким промиванням водою, або знебарвлюють зерна волютину обробкою 5%-м розчином соди.

Фарбування включень волютину за методом Омелянського. Фіксований препарат фарбують 30...60 с карболовим фуксином Ціля, промивають водою і занурюють на 20...30 с в 1%-й розчин сірчаної кислоти. Потім швидко промивають водою. Обробка кислотою знебарвлює цитоплазму, яку для контрастування додатково дофарбовували 15...30 с метиленовим синім (в розведенні 1:40). Після промивання водою препарат обережно підсушують фільтрувальним папером. Цитоплазма клітини забарвлюється в синій колір, а зерна волютину залишаються пофарбованими в червоний колір.

Фарбування включень глікогену. Включення глікогену забарвлюються розчином Люголя в червоно-бурий колір. На предметне скло наносять краплю суспензії дріжджових клітин. До краплі суспензії додають краплю розчину Люголя і накривають покривним склом.

Фарбування включень жиру. Для фарбування включень жиру використовують барвники, що розчиняються у жирі:

а) на фіксований препарат наносять краплю розчину судану III і накривають покривним склом. Включення жиру забарвлюються в червоний колір, а цитоплазма залишається безбарвною;

б) на предметне скло наносять краплю 40%-го розчину формаліну і вносять в неї бактеріальної петлею культуру дріжджів. Під дією формаліну клітини гинуть, і розпушується їх оболонка. Через 5 хв. до краплі інактивованої дріжджової суспензії додають крапельку розчину метиленового синього (1:40), витримують 10 хв. і додають краплю розчину судану ІІІ. Препарат накривають покривним склом і видаляють надлишок рідини фільтрувальним папером. Включення жиру забарвлюються в рожево-оранжевий колір, а цитоплазма в синій.

6.2.4. Приготування розчинів барвників

Розчини метиленового синього. Для фарбування препаратів живих культур дріжджів готують 0,01%-й і 0,001%-й водні розчини метиленового синього. Для цього відповідно 10 мг або 1 мг сухого барвника розчиняють в 100 мл дистильованої води.

Для фарбування фіксованих препаратів спочатку готують насичений спиртовий розчин метиленового синього, який перед використанням розводять дистильованою водою (1:10 або 1:40). Насичений розчин метиленового синього в 95%-му етанолі готують, додаючи 10 г сухого барвника до 100 г етанолу або 3 г барвника до 100 см³ етанолу. Розчинення проводять протягом 3 діб, періодично струшуючи або перемішуючи, потім розчин відфільтровують.

Фарбувальну здатність розчинів метиленового синього підсилює додавання в розчин лугу. Тому в деяких випадках при мікроскопічних дослідженнях використовують лужний розчин метиленового синього. Для його приготування 30 см³ насиченого спиртового розчину метиленового синього розбавляють 100 см³ дистильованої води і додають 1 см³ 1%-го розчину гідроксиду калію.

Розчини фуксину. Для отримання насиченого спиртового розчину фуксину (фуксин основний), розчиняють 10 г сухого барвника в 100 см³ етанолу. Розведений розчин фуксину отримують додаванням до 10...20 см³ насиченого розчину фуксину 100 см³ дистильованої води. Водні розчини фуксину отримують, розчиняючи 1...10 г сухого барвника в 100 мл дистильованої води.

Карболовий фуксин Ціля готують, розтираючи в порцеляновій ступці 1 г фуксину з 10 см³ етанолу. Потім при розтиранні додають 5 г фенолу (карболової кислота) і поступово, продовжуючи розтирати, доливають 100 см³ дистильованої води. Карболовий фуксин можна приготувати, розчиняючи 10 см³ насиченого спиртового розчину фуксину в 100 см³ 5%-го водного розчину фенолу. Іноді для звичайного фарбування застосовують карболовий фуксин, розведений у 10 разів дистильованою водою. Але цей розчин не стійкий при зберіганні і тому готується перед застосуванням.

Розчин Люголя. 20 г йодиду калію розчиняють в 100 мл дистильованої води і додають 7 г йоду. Для прискорення розчинення суміш розтирають у порцеляновій ступці.

Розчин судану ІІІ. Судан III - азокраситель, не розчиняється у воді, але здатний розчинятися в рідких жирах (маслах). Для забарвлення препарату з метою виявлення жирових включень у клітинах мікроорганізмів звичайно використовують розчин судану III в суміші рівних обсягів етанолу та гліцерину. Концентрація барвника в розчині повинна бути не менше 0,5%. Для приготування розчину сухий порошок судану ІІІ розчиняють в 96%-му етиловому спирті, до якого потім додають рівний об'єм гліцерину. Для забарвлення препаратів можна також використовувати розчини судану III в молочній кислоті, в 70%-му етанолі та в суміші 70%-го етанолу та ацетону.

 

6.2.5.Оцінка фізіологічного стану дріжджів за мікроморфологічними характеристикам.

При оцінці фізіологічного стану дріжджів враховують середній розмір і форму клітин, вік, активність брунькування або ділення, наявність мертвих клітин. Досліджується і внутрішня структура клітин (товщина стінки, однорідність цитоплазми, наявність і розміри вакуолей, наявність включень).

Подрібнення дріжджових клітин і спотворення їх форми вказує на нестачу харчування, витягування клітин може свідчити про нестачу кисню. Нестача харчування також приводить до вичерпання резервних речовин, цитоплазма стає зернистої, пропадають вакуолі. З віком товщає оболонка клітини, цитоплазма стає зернистої, з'являються і збільшуються в розмірах вакуолі, укрупнюються крапельки жиру і зменшується вміст волютину. Вважають, що дріжджі активно брунькуються або подвоюються, якщо число клітин, що брунькуються або діляться, складає не менше 50% загального їх числа. Мертві клітини при вирощуванні дріжджів на темних середовищах набувають темний колір. На нефарбованих середовищах вони залишаються безбарвними, але на відміну від живих клітин краще сприймають барвники. Забарвлення проводять свіжоотриманим водним розчином метиленового блакитного (розведення 1:10000). Живі клітини залишаються безбарвними, а мертві забарвлюються. Живі клітини під дією барвника гинуть, тому забарвлений препарат досліджують відразу ж після приготування. У нормальному стані число мертвих клітин не перевищує 1...5%.

 

6.2.6. Робота з оптичним мікроскопом

Оптичний мікроскоп (рис. 15) дає збільшення в десятки, сотні і навіть тисячі разів, що дозволяє безпосередньо спостерігати досліджувані об'єкти. Основні частини мікроскопа: оптична система, освітлювальна система, предметний столик і штатив. Оптична система складається з об'єктиву і окуляру, що з'єднані тубусом. На об'єктиві і окулярі вказується їх збільшення. Добуток цих збільшень дасть загальне збільшення мікроскопа. Освітлювальна система включає в себе джерело освітлення, двостороннє дзеркало (одна сторона плоска для природного освітлення, інша - увігнута для штучного освітлення) і конденсор з діафрагмою.

Рис. 15. Оптичний мікроскоп: 1 - дзеркало, 2 - конденсор, 3 - предметний столик, 4 - предметне скло, 5 - об'єктив, 6 - окуляр, 7 - тубус, 8 - макрометріческій гвинт, 9 - мікрометричний гвинт, 10 – штатив

 

На початку роботи домагаються правильного освітлення поля зору мікроскопа. При використанні зовнішнього освітлювача вихідний від нього пучок світла за допомогою увігнутого дзеркала направляють в наглядову систему мікроскопа. Діафрагма конденсора при цьому відкрита, а сам конденсор піднятий. При правильній установці освітлення поле зору мікроскопа має форму кола, добре і рівномірно освітленого. На предметний столик мікроскопа поміщають досліджуваний препарат і закріплюють його клемами. Попередній огляд препарату проводять при малому збільшенні (з об'єктивом х8).

Слід пам'ятати, що вільна робоча відстань (відстань між об'єктивом і сфокусованим препаратом) залежить від збільшення об'єктиву: для х8 це відстань 8 мм, для х40 - 0,6 мм, для х90 - 0,15 мм. Тому спочатку, спостерігаючи за об'єктивом збоку, за допомогою макрометричного гвинта опускають тубус мікроскопа і наближають об'єктив до препарату на відстань, меншу за робочу. Потім, дивлячись в окуляр, обертанням макрометричного гвинта піднімають тубус до появи в полі зору досліджуваного об'єкта. Далі за допомогою мікрометричного гвинта фокусують об'єкт, домагаючись чіткого зображення. Переміщенням конденсора і діафрагмою регулюють освітленість. Препарат досліджують по всій його поверхні, пересуваючи предметний столик бічними гвинтами. При переході до більшого збільшення (об'єктив х40) злегка відкривають діафрагму і мікрометричним гвинтом проводять фокусування.

Для мікроскопічного дослідження бактерій та внутрішньоклітинних структур користуються імерсійним об'єктивом. На досліджуваний препарат наноситься крапля імерсійної рідини, що має близький до скла показник заломлення. Імерсійний об'єктив (х90) за допомогою макрометричного гвинта занурюють в імерсійну рідину (кедрове масло), не торкаючись препарату. Потім, дивлячись в окуляр, тим же гвинтом дуже повільно піднімають тубус до появи зображення. Фокусують препарат мікрометричним гвинтом, який можна обережно обертати не більше ніж на половину обороту в ту або іншу сторону.

Після закінчення роботи слід підняти тубус мікроскопа, зняти препарат з предметного столика, привести в робоче положення об'єктив х8, видалити м'якою тканиною імерсійне масло з об'єктиву х90, відключити освітлювач і накрити мікроскоп поліетиленовим ковпаком.

Для підвищення контрастності нефарбованих прозорих живих об'єктів використовують мікроскопію у відбитому світлі, темнопольну мікроскопію і фазово-контрастну мікроскопію.

Темнопольна мікроскопія заснована на висвітленні об'єкта бічними променями світла, які не потрапляють в об'єктив. Спеціальний темнопольний конденсор має затемнену середню частину, що не проникна для центральних променів світла в об'єктив, тому поле зору виглядає абсолютно чорним. У площину препарату потрапляють тільки бічні промені, відбиті від дзеркальних поверхонь, розташованих всередині конденсора. Ці бічні промені освітлюють клітини, що містяться в препараті.

У результаті клітини мікроорганізмів у препараті "роздавлена ​​крапля" будуть яскраво освітленими об'єктами на темному тлі. Для темнопольній мікроскопії потрібно більш потужне джерело світла, ніж для мікроскопії в світлому полі, товщина препарату повинна бути мінімальною, а предметні скла стандартної товщини (до 1,2 мм).

Препарат дріжджових клітин "роздавлена ​​крапля" поміщають на предметний столик мікроскопа і фокусують при малому збільшенні (об'єктив х8) зі світлопольним конденсором. Потім замінюють конденсор на темнопольний. На лінзу конденсора наносять краплю імерсійного масла і піднімають конденсор до зіткнення краплі олії з предметним склом. Крапля повинна рівномірно заповнювати простір між лінзою конденсора і предметним склом і не містити бульбашок повітря. Переглядають препарат, користуючись об'єктивом х40.

Фазово-контрастна мікроскопія. У полі зору звичайного біологічного мікроскопа контрастними будуть об'єкти, які різною мірою поглинають світло у порівнянні з навколишнім середовищем. Оскільки при поглинанні світла відбувається зменшення амплітуди світла, що проходить, такі об'єкти називають амплітудними. Об'єкти, які поглинають світло, що проходить, в тій же мірі, що і навколишнє середовище, але відрізняються від неї значенням коефіцієнта заломлення, називають фазовими. При проходженні світла через такий об'єкт відбувається тільки зміна фази світлової хвилі, що проходить, за рахунок різниці в показниках заломлення. У фазово-контрастної мікроскопії методом інтерференційного контрастування перетворюють невидимі людському оку відмінності по фазі в зміни амплітуди світла. Інтерференційна мікроскопія робить можливим спостерігати без фарбування не тільки прозорі клітини живих мікроорганізмів, але і внутрішньоклітинні структури з різними показниками заломлення. У біологічних лабораторіях використовують для якісних та кількісних досліджень мікроорганізмів поляризаційно-інтерференційні мікроскопи.