Введення гена у вектор і клонування

Дуже важливою операцією в генній інженерії є введення в клітину і стабільна підтримка генетичної інформації, що міститься в рекомбінантних молекулах ДНК.

ДНК, що введена в бактеріальну клітину, гідролізується її ферментами до нуклеотидів. Якщо навіть ДНК «виживає» в клітині, то вона втрачається в процесі подвоєння. Для того, щоб рекомбінантна ДНК стала складовою частиною геному клітини, вона повинна або інтегруватися в хромосому і реплікуватися за її рахунок, або бути здатною до автономної реплікації. Це досягається за допомогою векторних молекул (векторів). Рекомбінантні ДНК привносять в організм реципієнта нові властивості: синтез амінокислот і білків, гормонів, ферментів, вітамінів та ін.

Вектор – молекула ДНК, здатна переносити в клітину чужорідну ДНК і забезпечувати там її розмноження (клонування) або рідше – включення в геном. До векторів пред'являються певні вимоги:

- кільцева молекула ДНК може реплікуватись в клітинах, якщо містить ДНК-реплікатор (оri-послідовність).

- вектор повинен містити унікальні сайти рестрикаціі для декількох рестриктаз,

- володіти певною ємністю і не викидати вбудований фрагмент;

- містити маркерний ген, що полегшує відбір клітин, несучих вектор,

- ген повинен експресуватися (створюється продукт, синтезований за інформацією введеного гена);

- містити специфічні для даної клітини промотори і термінатори («стоп»-кодони) транскрипції.

У свою чергу, РНК-транскрипт буде транслюватися, якщо РНК містять сигнали зв'язування з рибосомами і кодони ініціації і термінації трансляції.

Вбудовування чужорідного фрагмента ДНК в геном вектора здійснюється в два етапи: спочатку ДНК вектора розрізається за допомогою рестриктази, а потім у них вбудовується чужорідний фрагмент.

При відсутності комплементарних «липких» кінців у фрагментів, що зшиваються, їх добудовують за допомогою лінкерів.

В якості векторів використовують, як правило, плазміди, бактеріофаги, мобільні елементи, віруси тварин. В даний час створена велика кількість векторів, і за профілем використання їх можна підрозділити на кілька типів.

1. Вектори для клонування. Використовують для ампліфікації (збільшення кількості) шляхом реплікації фрагменту ДНК, що вбудований у такий вектор. Для цього найчастіше використовують бактеріальні плазміди і фаги. Для клонування великих фрагментів геному використовують вектори – штучні бактеріальні і дріжджові хромосоми (ВАС і YАС).

2. Вектори експресії. Їх використовують для аналізу певних послідовностей генів і білкових продуктів, а також для наробітки певного білку. Існує значна кількість систем експресії, особливо для прокаріотичних організмів. Є також вектори для експресії генів у клітинах дріжджів, рослин і тварин. Вектори експресії для еукаріотів завжди містять промотор, здатний працювати у даному типі організму і сайт поліаденілірування (роІу(А) – хвіст), який складається приблизно з 200 залишків аденозину. Наявність роІу(А)- хвосту дозволяє відокремити матричну - мРНК від рибосомальної – рРНК і транспортної - тРНК, а також надає можливість приєднання олігомерів oligo(dТ), які ініціюють синтез комплементарних ДНК-копій (кДНК) на підставі мРНК за допомогою рестриктази.

3. Вектори для трансформації. Використовують для введення чужорідного фрагменту ДНК у геном реципієнту. Як правило, такі вектори містять специфічні послідовності, які сприяють інтеграції у геном.

Сучасні векторні системи часто бувають поліфункціональні і з’єднають декілька функцій в одному векторі.

Більшість з них сконструйовано за допомогою методів генної інженерії.
В якості векторів прокаріотів використовують плазміди, бактеріофаги
і їх комбінації. Плазміди - це бактеріальні позахромосомні дволанцюгові кільцеві молекули ДНК з варіабельними молекулярними масами (1…3% генома бактеріальної клітини). Використовують плазміди, здатні розмножуватися автономно, створюючи до 200 копій, а під дією інгібітору біосинтезу протеїнів (хлорамфеніколу) - до кількох тисяч. Використовують конʹюгативні плазміди (F) і неконʹюгативні (R, Col, D).

R -плазміди містять гени стійкості до антибіотиків,
Col -плазміди забезпечують синтез різних коліцинів - високоспеціфіческіх антибіотиків, що пригнічують жізнедеятельність інших штамів і видів бактерій, D-плазміди викликають біодеградацію. Бактеріальна клітина зазвичай може містити у своєму складі плазміди тільки одного типу.

Вбудовування чужорідної ДНК у векторну плазміду - досить рідка подія. Тільки одна з 10…30 отриманих після легування молекул буде рекомбінантної, тобто нести у своєму складі чужорідний
фрагмент. Такі клітини відбирають на селективної середовищі з
антибіотиками.

Плазмідні вектори мають невелику ємність, в них
можна клонувати фрагменти довжиною не більше 7-8 тисяч нуклеотідних пар (т.н.п.), тобто вони придатні тільки для клонування генів прокаріотів. В генетичної інженерії часто використовують плазміду рВR 322, яка містить реплікатор коліциногенної плазміди Col Е1, ген стійкості до антибіотиків -
ампіциліну (Amp ') і тетрацикліну (Тс').

Плазмідні вектори використовуються найчастіше для розмножування (клонування) гена. В даний час клонування генів успішно здійснюється за допомогою полімеразої ланцюгової реакції (ПЛР) в спеціальних автоматах.

Фрагмент ДНК (ген) поміщають в прилад, додають праймери (олігонуклеотиди, комплементарні кінцям фрагмента ДНК), нуклеотиди,
ДНК-полімеразу. Розчин нагрівають до 95°С, викликаючи денатурацію ДНК. Потім суміш охолоджують до 50…65°С, і праймери прикріплюються до кінців кожної вільної нитки ДНК. Знову підвищують температуру до 72°С, і ДНК-полімераза починає приєднувати нуклеотиди до праймерів і будувати копії ланцюжка ДНК. Змінюючи температуру, повторюють цикл і копіюють ДНК десятки і сотні разів. Після 20 циклів рахунок йде на мільйони.

Для прокаріотів сконструйовані вектори на основі фага λ, в які можна включати фрагменти чужорідної ДНК до 22 т.н.п. З генома фага вирізують його власну ДНК, кінцеві фрагменти фага залишаються незмінними, так як вони необхідні для реплікації і упаковки ДНК в головку фага (cos -сайти).

Для клонування і перенесення більших фрагментів ДНК (30…45 т.н.п.) були сконструйовані штучні вектори - косміди, що містять cos -ділянку генома фага, за рахунок чого вони можуть упаковуватися в голову фага λ і спеціальні послідовності (ori -сайт), що дозволяють їм реплікуватись
по типу плазмід.

Космідамі трансформують клітини E. coli, де вони розмножуються як плазміди, і кожна з фагових часток викликає утворення
колонії індивідуального бактеріального трансформанта.

Клонування фрагментів ДНК від 100 т.н.п. і більше здійснюється в спеціально сконструйованих векторах ВАС і VAC. ВАС -вектори отримані на основі F -плазмід бактерій і містять гени, відповідальні за реплікацію і копійність цих плазмід у бактеріальних клітинах. Ємність ВАС -векторів складає 100…300 т.н.п.

VAC -вектори являють собою штучну дріжджову мініхромосому, містять центроміру, теломери і точку початку реплікації. У такий вектор можна вбудувати фрагмент чужорідної ДНК більше 100 т.н.п., і така мініхромосома, що введена в клітини дріжджів, буде реплікуватися і вести себе аналогічно іншим дріжджовим хромосомам при мітозі.

Еукаріотичні віруси знайшли більш скромне застосування
в якості векторів.

Практично використовується тільки онкогенний вірус SV-40 і
його похідні. Всі ці вектори - дефектні віруси, не здатні створювати повноцінні вірусні частки в клітині господаря.

У прокаріот сумарну ДНК гідролізують рестриктазою і кожен з отриманих фрагментів вбудовують у вектор. Потім необхідно виявити специфічну лінію клітин (клон), яка містить необхідну послідовність, відділити її і охарактеризувати. Процес розділення геномної ДНК на елементи для клонування, введення цих елементів у клітини-хазяїв має назву створення геномної бібліотеки. Повна бібліотека за визначенням містить весь геном даного організму.

Один із способів створення бібліотеки ДНК полягає в обробці донорської ДНК рестриктазою в умовах, коли відбувається лише часткове розщеплення, таким чином, що створюються фрагменти різних розмірів. Частковий гідроліз дозволяє клонувати цілі гени, однак, оскільки сайти рестрикції розташовані не випадкове, деякі фрагменти можуть виявитися занадто великими для клонування. Для вирішення цієї проблеми використовують іншу додаткову рестриктазу.

Фрагменти, що отримані, з’єднують з ДНК векторів за допомогою лігази і, за можливістю, упаковують в підготовлені головки фагових часточок. Бібліотеку зберігають у вигляді фагового банку під хлороформом при t= - 70° С. Таким чином бібліотека здатна зберігатися десятки років. Ампліфікацію бібліотеки (розмноження) отриманих геномних клонів, а також розшук необхідного клону проводять при зараженні фагової бібліотекою бактеріальні клітини, які потім висівають на чашках Петрі з агаризованим середовищем. Повний гаплоїдний набір клітин ссавців містить біля 3 · 10⁹ пар основ. При ємності вектору 15 т.п.н. бібліотека може містити біля 1 млн. фагових часточок. Перевірка мільйона фагових бляшок дозволяє перевірити весь геном на наявність необхідного гена. Так можна ідентифікувати певно ті фагові часточки, які містять послідовність дослідженого гена, розмножити ДНК цієї послідовності і проводити з нею подальші маніпуляції.