Перелік навчальної літератури

 

1. Бекер М. Е. Введение в биотехнологию / М. Е. Бекер; [пер. с латышского]. — Рига: Пищевая промышленность, 1978. — 232 с.

2. Биотехнология / [отв. ред. А. А. Баев]. – М.: Наука, 1984. –318 с.

3. Биотехнология ферментативного превращения целлюлозы/ [А. П. Синицын, А. А. Клесов, М. Л. Рабинович и др.]. – М., 1998. – 156 с. (Биотехнология. Итоги науки и техники ВИНИТИ АН; Т. 12).

4. Биотехнология. Принципы и применение / [пер. с англ.; под ред. И. Хиггенса, Д. Беста, Дж. Джонса]. – М.: Мир, 1998. – 480 с.

5. Биотехнология: учеб. пособ. для вузов; в 8 кн. / [под ред. Н. С. Егорова, В. Д. Самуилова]. – М.: Высш. шк., 1987.

6. Біотехнологія: підручник / [В. Г. Герасименко, М. О. Герасименко, М. І. Цвіліховський та ін.]; за заг. ред. В. Г. Герасименка. – К.: Фірма «ІНКОС», 2006. – 647 с.

7. Волова Т. Г. Биотехнология / Т. Г. Волова. – Новосибирск: Сибир. отдел. РАН, 1999. – 252 с.

8. Герасименко В. Г. Биотехнология: учеб. пособ. / В. Г. Герасименко. – К.: Вища шк., 1989. – 343 с.

9. Глик Б. Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / Б. Б. Глик, Дж. Пастернак. – М.: Мир, 2002. – 589 с.

10. Евтушенко А. Н. Введение в біотехнологію: курс лекцій / А. Н. Евтушенко, Ю. К. Фомичев. – Мн.: БГУ, 2002. – 105 с.

11. Елинов Н. П. Основы биотехнологии / Н. П. Елинов. – СПб.: Наука, 1995. – 600 с.

12. Ефимова М. В. Введение в прикладную биотехнологию: учеб. пособ. / М. В. Ефимова. – Петропавловск-Камчатский: Камчат. ГТУ, 2004. – 95 с.

13. Клесов А. А. Инженерная энзимология на промышленном уровне. Биотехнология / А. А. Клесов. – М., 1989. – 184 с. – (Итоги науки и техники ВИНИТИ АН СССР).

14. Мосин О. В. Использование биотехнологии в пищевой и перерабатывающей промышленности: [Електронний ресурс] / О. В. Мосин. – 2009. – Режим доступу: http//www.biotechnol.ru/ ge/biblio/mosin_o_new2.htm.

15. Основи сельскохозяйственной биотехнологии / [Г. С. Муромцев, Р. Г. Бутенко и др]. – М.: Агропромиздат, 1990. – 384 с.

16. Сассон А. Биотехнология: свершения и надежды / А. Сассон; пер. с англ.; под ред. В. Г. Дебабова. – М.: Мир, 1987. – 411 с.

17. Шевелуха В. С. Сельскохозяйственная биотехнология / В. С. Шевелуха. – М.: Высш. шк., 2003. – 470 с.

18. Щелкунов С. Н. Генетическая инженерия: учеб.-справ. пособ. / С. Н. Щелкунов. – 2-е изд. испр. и доп. – Новосибирск: Сиб. унив., 2004. – 496 с.

ДОДАТОК

Відповіді на завдання

Завдання 1.

Існує 6 стадій біотехнологічного виробництва:

1. Приготування і стерилізацію поживних середовищ;

2. Приготування посівного матеріалу;

3. Культивування;

4. Обробку культуральної рідини;

5. Виділення та очистку біопрепарату;

6. Отримання готової продукції.

Дві початкові стадії включають підготовку сировини та біологічно діючого начала. У процесах інженерної ензимології вони зазвичай складаються з приготування розчину субстрату із заданими властивостями (рН, температура, концентрація) та підготовки партії ферментного препарату даного типу, ферментного або іммобілізованого. При здійсненні мікробіологічного синтезу необхідні стадії приготування поживного середовища і підтримання чистої культури, яка могла б постійно або по мірі необхідності використовуватися в процесі.

Підтримка чистої культури штаму-продуцента – головне завдання будь-якого мікробіологічного виробництва, оскільки високоактивний штам, який не зазнав небажаних змін, може служити гарантією отримання цільового продукту із заданими властивостями.

Третя стадія – стадія ферментації, на якій відбувається утворення цільового продукту. На цієї стадії йде мікробіологічне перетворення компонентів поживного середовища спочатку в біомасу, потім, якщо це необхідно, в цільової метаболіт.

На четвертому й п'ятому етапі з культуральної рідини виділяють і очищають цільові продукти. Для промислових мікробіологічних процесів характерно, як правило, утворення дуже розріджених розчинів і суспензій, що містять, крім цільового, велику кількість інших речовин. При цьому доводиться розподіляти суміші речовин дуже близької природи, що знаходяться в розчині в порівнюваних концентраціях, дуже лабільних, що легко піддаються термічній деструкції.

Заключна стадія біотехнологічного виробництва – приготування товарних форм продуктів. Загальною властивістю більшості продуктів мікробіологічного синтезу є їх недостатня стійкість до зберігання, оскільки вони схильні до розкладання і в такому вигляді представляють прекрасне середовище для розвитку сторонньої мікрофлори. Це змушує технологів приймати спеціальні заходи для підвищення зберігання препаратів промислової біотехнології. Крім того, препарати для медичних цілей вимагають спеціальних рішень на стадії фасування та закупорки, оскільки повинні бути стерильними.

2. Технологія приготування поживних середовищ для біосинтезу.
Основу поживних середовищ для культивування мікроорганізмів складають джерела вуглецю. Крім вуглецю клітини мікроорганізмів в процесі росту відчувають потребу в азоті, фосфорі, макро-та мікроелементах. Всі подібні речовини знаходяться в поживних середовищах у вигляді солей, за винятком середовищ, де азот і фосфор можуть засвоюватися зростаючими культурами з органічних джерел, наприклад автолізатів або гідролізатів мікробного або тваринного походження.

Рідкі і тверді джерела вуглецю звичайно вводять у вже готове поживне середовище безпосередньо перед ферментацією, це усуває небезпеку зараження сторонньої мікрофлорою, ймовірність якої зростає при зберіганні готової поживної суміші. При періодичної ферментації на початку процесу інокулят (засівна доза мікроорганізмів) вноситься у вже готове поживне середовище, що містить всі компоненти. Тому джерела вуглецю вводять безпосередньо перед засівом або окремі компоненти середовища вводять в міру споживання їх культурою, підтримуючи у ферментері деяку оптимальну їх концентрацію, яка на різних етапах ферментації може змінюватися за певним законом.

3. Найважливішим елементом приготування поживних середовищ є дотримання вимог асептики. Це або створення заданого значення рН, що забезпечує придушення сторонніх мікроорганізмів, або повна стерилізація всіх потоків, що подаються і самого біореактора.

Для стерилізації газових потоків (в першу чергу повітря) використовують процес фільтрації через спеціальні волокнисті фільтри з послідовно розташованими фільтруючими елементами. Фільтруючий матеріал періодично стерилізується подачею гострого пара у відключений фільтр через задані проміжки часу.

Метод фільтрації базується на здатності напівпроникних мембран з великими порами пропускати рідку фазу і концентрувати клітини мікроорганізмів. В принципі цей метод є ідеальним для стерилізації термічно нестійких рідких і газових речовин, оскільки може здійснюватися при низькій температурі і вимагає лише градієнта тиску по різні сторони мембрани. Основна трудність – наявність термостійких мембран, здатних витримувати багаторазову стерилізацію їх самих. В даний час ця проблема вирішується шляхом застосування термостійких полімерів у виробництві мембран.

Рідинні потоки стерилізують різними методами, з яких практичний інтерес представляють термічний, радіаційний, фільтраційний і хімічний. Термічний – найпоширеніший, при температурах порядку 120-150^оС. Радіаційний – випромінювання, застосовується рідко через труднощі створення та експлуатації потужних джерел цього випромінювання.
В окремих випадках застосовують хімічні агенти стерилізації. Основна проблема в цьому випадку – необхідність усунення агента стерилізації з поживного середовища після загибелі мікрофлори до внесення інокуляту. Хімічні антисептики повинні бути не тільки високоефективні, але і легко розчинятися при зміні умов після завершення стерилізації. До числа кращих відноситься пропіолактон, що володіє сильною бактерицидною дією і легко гідролізується в молочну кислоту.

4. Ні, метанол, етанол, концентрована оцтова кислота не вимагають стерилізації, так як вони самі мають асептичну дію. У цьому випадку обмежуються стерилізацією інших елементів поживного середовища.

5. Підтримка чистої культури та отримання засівної дози. У технологічному процесі використовуються корисні властивості штаму, отже, необхідно зберігати і, якщо можливо, покращувати його виробничі якості. Тому в біотехнологічному виробництві є відділення чистої культури, завданням якого є постійне і надійне відтворення корисних властивостей продуцента, знайдених або досягнутих у свій час в ході лабораторних досліджень. У міру необхідності з відділення чистої культури надходить задана маса інокулята, що йде у виробництво.

Посівні дози вирощуються послідовно в колбах і бутлях на 10-20 літрів, що знаходяться на гойдалках або просто в приміщенні, що термостатується, і далі в послідовності ферментерів об'ємом (за необхідністю) 10, 100, 500 і 1000 літрів, в яких здійснюється перемішування, аерація і термостатування культуральної рідини із клітинами.

При періодичному процесі культивування (при виробництві метаболітів) у відділенні чистої культури готують засівну дозу клітин для кожної з операцій основного виробництва. При безперервному виробництві кормового білка цього не потрібно, однак для підвищення якості продукту вважають за необхідне час від часу вводити клітини штаму-продуцента з відділення чистої культури. Для цього в відділенні є ферментаційна частина, де виробляється вирощування досить великих партій мікроорганізму продуцента.

 

Завдання 2

1.Найбільш поширеним методом генної інженерії є метод отримання рекомбінантних плазмід, які являють собою кільцеві, дволанцюгові молекули ДНК, що складаються з декількох пар нуклеотидів. Кожна бактерія окрім основної, не покидає клітину молекули ДНК (5∙10⁶ пар нуклеотидів), може містити кілька різних плазмід, якими вона обмінюється з іншими бактеріями.

Плазміди є автономними генетичними елементами, що реплікуються в бактеріальної клітиніі не в той же час, що основна молекула ДНК. Плазміди несуть важливі для бактерії гени, як гени лікарської стійкості. Різні плазміди містять різні гени стійкості до антибактеріальних препаратів. При дії певного антибіотика на бактерійні клітини плазміди, що додають стійкість до нього, швидко поширюються серед бактерій, зберігаючи їм життя.

2. Бактеріальні клітини виробляють рестріктази для руйнування чужорідної (фагової) ДНК, що необхідно для обмеження вірусної інфекції. Рестріктази дізнаються певної послідовності нуклеотидів (сайти - ділянки пізнавання) і вносять симетричні, розташовані навскіс один від одного розриви в ланцюгах ДНК на рівних відстанях від центру сайту. В результаті на кінцях кожного фрагмента рестріктованої ДНК утворюються короткі одноланцюгові «хвости», які називають липкими кінцями.

3. Для отримання рекомбінантної плазміди ДНК однієї з плазмід розщеплюється вибраною рестріктазою. Ген, який потрібно ввести в бактеріальну клітину, розщеплюють з ДНК хромосом людини за допомогою рестріктази, тому його «липкі» кінці є комплементарними нуклеотидної послідовності на кінцях плазмід. Ферментом лігази «склеюють» обоє шматка ДНК в результаті виходить рекомбінантна кільцева плазміда, яку вводять в бактерію, наприклад, E. coli. Всі нащадки цієї бактерії (клони) містять в плазмідах чужорідний ген. Весь цей процес називають клонуванням.

4. Як продуцентів різних рекомбінантних білків використовують:

Escherichia coli (кишкова паличка) - грамнегативна умовно-патогенна паличка, у якої в даний час детально вивчені геном і механізми експресії генів, мається плазміда, так званий власний вектор, на основі якої створено химерні плазміди, які містять гени-маркери стійкості до антибіотиків.

Bacillus subtilis (сінна паличка) - грампозитивний спороутворюючий непатогенний мікроорганізм, здатний адсорбувати і поглинати молекули ДНК із зовнішнього середовища і секретувати з клітин в культуральну рідину великі кількості білків.

Pseudomonas (псевдомонади) - грамнегативні умовно-патогенні і патогенні палички, здатні до накопичення рекомбінантних білків, на відміну від кишкової палички, в розчиненому стані за рахунок специфічних окисно-відновних потенціалів цитоплазми клітин.

Сахароміцети (пекарські дріжджі - Saccaromyces cerevisiae та пивні дріжджі - Saccaromyces carlsbergensis) - еукаріотичні клітини, здатні до посттрансляційної модифікації білків і містять другу мікронну дріжджову плазміду з селективним геном-маркером, що кодує синтез лейцину.

Сахароміцети здатні до ферментативної модифікації білків та екскреції рекомбінантних продуктів з клітки. Крім сахароміцетів використовують інші види дріжджів. Найбільш ефективними продуцентами повноцінних білків є метилотрофні дріжджи Pichia pastoris та Hansenula pofymorpha, здатні використовувати метанол як єдине джерело вуглецю та енергії.

Культури клітин тваринної тканини, які на відміну від культур мікроорганізмів, здатні здійснювати більш детальну модифікацію білків. Використовуються такі культури клітин:

культура клітин китайського хом'ячка CCL-2 (СНТ);

МК-2 - культура клітин нирки мавпи;

HLM -культура клітин печінки ембріона людини;

LM -культура клітин сполучної тканини м'язів.

5. Вектор - молекула ДНК, що здатна до самореплікації (наприклад, бактеріальна плазміда), яка використовувається в генній інженерії для переносу генів від організму донора до організму реципієнта, а також, для клонування нуклеотидних послідовностей.

 

Завдання 3

1. У харчовій промисловості за участю іммобілізованих ферментів йдуть процеси отримання глюкозо-фруктових сиропів, глюкози, яблучної та аспарагінової кислоти, оптично активних L-амінокислот, дієтичного безлактозную молока, цукрів з молочної сироватки та ін..

2. У медицині іммобілізовані ферменти відкрили шлях до створення лікарських препаратів пролонгованої дії зі зниженою токсичністю і алергенність. Іммобілізаційному підходи сприяють вирішенню проблеми спрямованого транспорту ліків в організмі. У медицині іммобілізовані ферменти використовуються також як лікарські препарати, особливо в тих випадках, коли необхідно локальне вплив. Крім того, біокаталізатори широко використовуються в різних апаратах для перфузійної очищення різних біологічних рідин. Можливості та перспективи використання в медицині ферментів в іммобілізованих стані набагато ширше, ніж досягнуті на сьогоднішній день, саме на цьому шляху медицину чекає створення нових високоефективних методів лікування.

3. Іммобілізовані клітини мають ряд переваг, як перед іммобілізованими ферментами, так і перед вільними клітинами:

- відсутність витрат на виділення та очистку ферментів;

- зниження витрат на виділення та очистку продуктів реакції;

- більш висока активність і стабільність;

- можливість створення безперервних і напівперервних автоматизованих процесів;

- здатність до тривалого функціонуванню поліферментних систем без екзогенних кофакторів.

4. Для іммобілізації можуть бути використані клітини в різному стані: живі та пошкоджені в різній мірі. Одностадійні реакції можуть здійснювати і живі, і пошкоджені клітини. Поліферментні реакції проводять із застосуванням живих клітин, які можуть тривалий час регенерувати АТФ і коферменти (НАДФ, НАД). Іммобілізувати можна не тільки клітини мікроорганізмів, але й клітини рослинних і тваринних тканин, використовуючи їх для синтезу фізіологічно активних сполук. Цікаві можливість відкриваються і при іммобілізації клітинних органел як активних Поліферментні систем. Все це свідчить про перспективність розвитку одного з напрямків біотехнології, пов'язаного з вивченням і застосуванням іммобілізованих клітин.

5. Хімічний метод заснований на утворенні ковалентних зв'язків з активованим носієм, на поперечній зшиванню клітин за рахунок активних груп в клітинній оболонці з біфункціональних реагентами (наприклад, глутарового альдегіду)

До фізичних методів відносяться адсорбція і агрегація. Іммобілізація клітин шляхом включення в різні гелі, мембрани, волокна заснована на хімічних і фізичних взаємодіях.

Хімічні методи використовуються рідше в порівнянні з іншими методами і малопридатні для іммобілізації живих клітин. Набагато більшого поширення набуло включення клітин до складу гелів, мембран і волокон. При такому способі іммобілізації клітини можуть зберігати життєздатність і в присутності живильного середовища розмножуватися в приповерхневих шарах гелів.

 

Завдання 4.

1. Вирішити ці проблеми допомагає створення в 1916р іммобілізованих ферментів.

2. Переваги іммобілізованих ферментів перед нативними попередниками:

- Гетерогенний каталізатор легко відділимо від реакційного середовища, що дає можливість зупинити реакцію в будь-який момент, використовувати фермент повторно, а також отримувати чистий від ферменту продукт.

- Ферментативний процес з використанням іммобілізованих ферментів можна проводити безперервно, регулюючи швидкість реакції, що каталізується, і вихід продукту.

-Модифікація ферменту цілеспрямовано змінює його властивості, такі як специфічність (особливо відносно макромолекулярного субстрату), залежність каталітичної активності від рН, іонного складу та інших параметрів середовища, стабільність до денатуруючих впливів.

-Можна регулювати каталітичну активність іммобілізованих ферментів шляхом зміни властивостей носія дією фізичних факторів, таких як світло і звук. Іммобілізувати ферменти можна як шляхом зв'язування на нерозчинних носіях, так і шляхом внутрішньомолекулярної або міжмолекулярної зшивки білкових молекул низькомолекулярними біфункціональними сполуками, а також шляхом приєднання

3. До носіїв пред'являються наступні вимоги (Дж.Порат, 1974):

- Висока хімічна та біологічна стійкість;

- Висока хімічна міцність;

- Достатня проникність для ферменту і субстратів, пористість, велика питома поверхня;

- Можливість отримання зручних в технологічному відношенні форм (гранул, мембран);

- Легка активація;

- Висока гідрофільність;

- Невисока вартість.

4. Класифікація носіїв для іммобілізованих ферментів

Слід зазначити, що органічні носії (як низько-, так і високомолекулярні) можуть бути природного або синтетичного походження. Природні полімерні органічні носії ділять відповідно до їх біохімічної класифікацією на 3 групи:

полісахаридні, білкові і ліпідні.

Синтетичні полімери також можна розділити на групи за хімічною будовою зв'язку основного ланцюга макромолекул: поліметиленового, поліамідні, поліефірні.

5. Найбільш часто для іммобілізації використовуються такі полісахариди, як целюлоза, декстран, агарози та їх похідні. Для збільшення механічної міцності целюлозу гранулюють шляхом часткового гідролізу, в результаті якого руйнуються аморфні ділянки. На їх місце для збереження пористості між кристалічними ділянками вводять хімічні зшивки. Гранульовану целюлозу досить легко перетворити в різні іонообмінні похідні, такі як ДЕАЕ-целюлоза, КМЦ і т.д.
Широко поширені носії на основі декстрану, що випускаються під назвою "сефадексе". При висушуванні вони легко стискуються, у водному розчині сильно набухають. У цих носіях розмір пор в гелі регулюється ступенем зшивання. До групи декстранів відносять і крохмаль. Хімічно модифікований крохмаль зшивається агентами, такими як формальдегід. Таким способом було отримано губчастий крохмаль, що володіє підвищеною стійкістю по відношенню до ферментів, гідролізу.

6. Хорошим носієм вважається агар. Його властивості поліпшуються після хімічної зшивки, наприклад, діепоксіднимі сполуками. Такий агар стає стійким до нагрівання, міцний, легко модифікується.

7. Білки в якості носіїв володіють рядом достоїнств: місткі, здатні до біодеградації, можуть застосовуватися в якості тонкої (товщиною 80 мкм) мембрани. Іммобілізацію ферментів на білкових носіях можна проводити як у відсутності, так і в присутності зшиваючих агентів.
До недоліків білків в якості носіїв відносять їх високу імуногенність (за винятком колагену і фібрину). Найчастіше для іммобілізації використовуються структурні (кератин, фібрин, колаген), рухові (міозин) і транспортні (альбумін) білки.

 

Навчальне-методичне видання

ЗАГАЛЬНА БІОТЕХНОЛОГІЯ

 

МЕТОДИЧНІ РЕКОМЕНДАЦІЇ

Методичні рекомендації

для самостійного вивчення дисципліни

і виконання лабораторних робіт

студентами денної форми навчання

спеціальності 6.051401-"Біотехнологія"

 

Автор О.І.Юлевич

 

Формат 60х84,1/16. Ум.друк.арк.7,06

Тираж 30 прим. Зам.№______

 

Надруковано у видавничому відділі

Миколаївського національного аграрного університету

54029, м.Миколаїв, вул. Паризької комуни, 9

 

Свідоцтво суб’єкта видавничої справи ДК № 1155 від 17.12.2002 р.