Миколаївський національний аграрний університет

МИКОЛАЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

Факультет технології виробництва і переробки продукції тваринництва, сертифікації та біотехнології

Кафедра генетики, годівлі тварин та біотехнології

 

 

ЗАГАЛЬНА БІОТЕХНОЛОГІЯ

Методичні рекомендації для самостійного вивчення дисципліни

і виконання лабораторних робіт студентами денної форми навчання спеціальності 6.051401-"Біотехнологія"

 

Миколаїв 2013

УДК 547(075.8)

ББК 24.2я73

Ю32

Друкується за рішенням науково-методичної комісії факультетутехнології виробництва і переробки продукції тваринництва, сертифікації та біотехнології Миколаївського національного аграрного університету від “_____”____________2013р., протокол №____

Автор: Юлевич О.І.

 

 

Рецензенти:

Ковтун С.І. – заступник директора з наукової роботи Інституту розведення і генетики тварин НААН, доктор с.-г. наук, професор, член-кореспондент НААН

Кот С. П. – завідувач кафедри зоогігієни, ветеринарії та безпечності продукції МНАУ, к.б.н., доцент

 

 

© Миколаївський національний аграрний університет, 2013

З М І С Т

	Вступ
1.	Загальні правила техніки безпеки в лабораторії на заняттях з біотехнології
2.	Підготовка посуду і обладнання до роботи з живими об’єктами
3.	Техніка підготовки і методи стерилізації поживних середовищ
3.1.	Вимоги, що надаються до поживних середовищ
3.2.	Склад і спосіб приготування поживних середовищ
3.3.	Характеристики компонентів поживних середовищ
3.4.	Стерилізація поживних середовищ
4.	Методи генетичної інженерії
4.1.	Методи отримання генів
4.2.	Введення гена у векторі клонування
4.3.	Методи трансформації клітин рослин і тварин
4.4.	Скринінг
4.5.	Експрессія (функціонування чужорідних генів в геномі бактерій, рослин і тварин
4.6.	Визначення генних продуктів у «брудній» суміші
5.	Методи виділення чистих культур мікроорганізмів
5.1.	Допоміжні операції
5.1.1.	Пересівання мікроорганізмів
5.1.2.	Розлив агарізованих середовищ в чашки Петрі
5.2.	Виділення чистої культури мікроорганізмів
5.2.1.	Крапельний метод
5.2.2.	Методи поверхневого посіву на щільне середовище
6.	Морфологія мікроорганізмів
6.1.	Макроморфологічні характеристики
6.1.1.	Зростання у рідких середовищах
6.1.2.	Зростання на щільних середовищах
6.2.	Мікроморфологічні характеристики
6.2.1.	Приготування препаратів живих культур
6.2.2.	Приготування постійних (фіксованих) препаратів
6.2.3.	Фарбування препаратів
6.2.4.	Приготування розчинів барвників
6.2.5.	Оцінка фізіологічного стану дріжджів
6.2.6.	Робота з оптичним мікроскопом
6.2.7.	Вимірювання дріжджових клітин
7.	Біотехнологія і харчова промисловість
7.1.	Наявність каталази у продуктах рослинного та тваринного походження
7.2.	Використання мікроорганізмів в хлібопеченні
7.3.	Мікроорганізми і виробництво молока і молочних продуктів
8.	Сучасні біотехнологічні методи та виробництва
8.1.	Розрахунок компонентів цукрового сиропу і кольору та компонентів купажного сиропу
8.1.1.	Розрахунок компонентів цукрового сиропу і кольору
8.1.2.	Розрахунок компонентів купажного сиропу
	Індивідуальні завдання для практичних занять
8.2.	Полісахариди. Крохмаль та клітковина
8.2.1.	Крохмаль
8.2.2.	Клітковина
9.	Застосування іммобілізованих ферментів
9.1.	Іммобілізація клітин Рseudomonas fluorescens в гелі альгінат кальцію
10.	Клітинна інженерія рослин
10.1.	Метод вегетативного розмноження
10.2.	Культивування калюсних тканин
10.3.	Приготування поживних середовищ для культивування ізольованих клітин і тканин рослин
10.4	Приготування поживного середовища Мурасіге-Скуга (М-С)
10.5.	Отримання і культивування калюсної тканини з коренеплодів моркви
11.	Екологічна біотехнологія
11.1.	Очищення стічних вод
11.2.	Біохімічні методи очищення стічних вод
11.3.	Розрахунок можливості сумісного очищення виробничих та побутових стічних вод
11.4	Розрахунок витрати стічних вод в аеротенках
12.	Сільськогосподарська біотехнологія
12.1.	Депонування пестицидів в матрикс з біополімерів, що руйнуються. Дослідження динаміки руйнування матриксу в ґрунті
	Перелік навчальної літератури
	Додаток

Вступ

Розвиток біотехнології дозволяє істотно інтенсифікувати
виробництво, підвищити ефективність використання природних ресурсів, вирішити екологічні проблеми, створити нові джерела енергії. Можливості біотехнології при міжнародному співробітництві фахівців можуть бути спрямовані на вирішення світових кризових проблем, пов'язаних з поповненням дефіциту білка та енергії, запобіганням небезпечних захворювань, охороною навколишнього середовища.

В даний час досягнення біотехнології перспективні в наступних галузях:

● промисловості (харчова, фармацевтична, хімічна, нафтогазова) – використання біосинтезу і біотрансформації нових речовин на основі сконструйованих методами генної інженерії штамів бактерій і дріжджів із заданими властивостями;

● екології – підвищення ефективності екологізації захисту рослин, розробка екологічно безпечних технологій очищення стічних вод, утилізація відходів агропромислового комплексу, конструювання екосистем;

● енергетиці – застосування нових джерел біоенергії, отриманих на основі мікробіологічного синтезу і модельованих фотосинтетичних процесів, біоконверсії біомаси в біогаз;

● сільському господарстві – розробка в області рослинництва трансгенних агрокультур, біологічних засобів захисту рослин, бактеріальних добрив, мікробіологічних методів рекультивації ґрунтів; в області тваринництва – створення ефективних кормових препаратів з рослинної, мікробної біомаси та відходів сільського господарства;

● медицині – розробка медичних біопрепаратів, моноклональних антитіл, діагностикумів, вакцин, розвиток імунобіотехнології.

У рекомендаціях подано ряд завдань практичного плану, виконання яких дозволить студентам краще ознайомитися з досягненнями та різноманітними методами, використовуваними в сучасній біотехнології.

Лабораторний практикум з дисципліни "Загальна біотехнологія" включає в себе роботи з вивчення властивостей біологічних агентів і методів їх використання в біотехнологічних процесах.

Промислова біотехнологія об'єднує методи переробки, в яких для отримання цінних продуктів використовуються живі організми та біологічні процеси. Якщо в хімічній технології на сировину впливають хімічними реагентами, то в біотехнологічних процесах на вихідний матеріал - субстрат впливають біологічними агентами.

Біологічними агентами можуть бути мікроорганізми, клітини тварин і рослин і виділені з клітин біологічні структури

Робота в біотехнологічної лабораторії повинна проводитися в асептичних умовах, Тобто в умовах, що попереджають потрапляння чужорідних, сторонніх мікроорганізмів на досліджувані об'єкти.
Створення асептичних умов передбачає дезінфекцію приміщень, стерилізацію інструментів і матеріалів. Робочі приміщення повинні бути обладнані вентиляцією. Лабораторні приміщення обладнані шафами, полицями для зберігання апаратури, посуду, реактивів. До складу оснащення лабораторії обов'язково входять: газові або спиртові пальники, штативи для пробірок, скляні шпателі (шпатель Дрігальского), піпетки градуйовані і Пастера, пінцети, бактеріальні петлі (гачки, голки), ножиці, фільтрувальний папір, предметні і покривні скла, біологічні мікроскопи, лупи, установки для культивування мікроорганізмів, бікси для стерилізації, набори барвників і реактивів для фарбування препаратів. В лабораторії повинен бути присутнім певний набір лабораторного посуду, що включає пробірки, чашки Петрі, колби Виноградського і Лінднера, качалочні колби, флакони Ру (матраци), промивалки, ампули та ін.

У лабораторному практикумі з дисципліни "Загальна біотехнологія" поряд із загальними правилами з охорони праці та техніки безпеки (ТБ) при роботі в хімічній лабораторії, повинні дотримуватися вимог, що зумовлені специфікою мікробіологічної лабораторії.

Склад деревної сировини

Показники	Породи дерев
листвяні	хвойні
Целюлоза, %	28-48	40-48
Геміцелюлоза, %	22-35	20-25
Лігнін, %	20-25	28-31
Органічні кислоти, %	10-12	4-5

Для вирощування мікроорганізмів використовують гідролізати деревних відходів.

 

Завдання 1.

У загальному вигляді система біотехнологічного виробництва продуктів мікробного синтезу представлена ​​на схемі (рис.4).

1. Скільки стадій біотехнологічного виробництва Ви знаєте? Назвіть їх і охарактеризуйте відбуваються в них процеси.

 

Продуцент		Підготовка посівного матеріалу		Поживне середовище
		Культивування
		Розподілення
Культуральна рідина				Клітини
		Біомаса вбитих клітин		Біомаса живих клітин
Дезінтеграція вбитих клітин
Виділення и очищення метаболітів
Концентрування		Концентрування		Концентрування
Стабілізація продукту		Стабілізація продукту		Стабілізація продукту
Зневоднення		Зневоднення		Зневоднення

 

Сухий продукт

Рідкий продукт

Сухий продукт

Рідкий продукт

Сухий продукт

Рідкий продукт

 

Зберігання

Використання

Рис.4. Принципова біотехнологічна схема виробництва продуктів мікробного синтезу

2. Розкажіть про технології приготування поживних середовищ для мікробіологічного синтезу речовини. Що входить до складу поживного середовища? Особливості введення в середу джерел вуглецю.

3. Асептика при приготуванні поживного середовища в процесі мікробіологічного синтезу. Стерилізація газових і рідинних потоків. Вимоги до хімічних антисептиків.

4. Чи потребує стерилізації середовище, в якому субстратами служать метанол, етанол або концентрована оцтова кислота? Чому? Як досягається дотримання асептики в даному випадку?

 

Питання для самоперевірки

1. Перерахуйте основні стадії біотехнологічної схеми отримання продуктів мікробного синтезу.

2. Як визначити фізіологічні потреби мікроорганізмів у поживних речовинах?

3. Які методи застосовують для знезараження поживних середовищ в біотехнологічному виробництві?

4. Опишіть послідовність отримання посівного матеріалу для промислового виробництва цільового продукту.

5. Основне призначення ферментера.

6. Від чого залежить проведення стадії виділення цільового продукту?

7. Які методи застосовують для відділення біомаси клітин від культуральної рідини?

8. Що таке дезінтеграція, в яких випадках її здійснюють?

9. Розкажіть про основні методи дезінтеграції клітин.

10. У чому відмінність сепарування від центрифугування?

11. У яких випадках виконується стадія очищення цільового продукту?

12. Що таке сорбція?

 

Методи генетичної інженерії

 

У новій біотехнології частіше використовуються віруси і бактерії, рослини і тварини та їх клітини, отримані (або поліпшені) з використанням методів генетичної інженерії.

Послідовність генно-інженерних процесів наступна:

1. Отримання генів.

2. Введення гена в вектор і їх клонування.

3. Методи трансформації тваринних і рослинних клітин.

4. Скринінг - відбір бактерій або клітин, в яких вбудований ген.

5. Експресія (функціонування) генів у реципієнта.

6. Виловлювання генних продуктів з «брудної» суміші.

 

Методи отримання генів

1. Хімічний синтез. Розшифрувавши послідовність амінокислот у білку і використовуючи генетичний код, визначають послідовність нуклеотидів ДНК на ділянці гена і здійснюють його синтез з нуклеотидів за допомогою ферменту ДНК-полімераза-1. Таким шляхом в 1969 р. Корані вперше синтезував ділянку молекули ДНК, що кодує аланінову т-РНК, а в 1977 р. Бойєр синтезував ген соматостатину людини, а потім і ген інсуліну. У 1977 р. В. Гілбертом, а також Ф. Сенгером був запропонований метод секвенування, тобто розпізнавання послідовності нуклеотидів в фрагментах нуклеїнових кислот. Метод хімічного синтезу генів виявився трудомістким і малоефективним.

Потім з'явилися швидкі і прості методи синтезу порівняно довгих олігонуклеотидів з певною, заздалегідь заданою, послідовністю нуклеотидів. Тепер досить легко можна синтезувати послідовність до 100 нуклеотидів. Автоматизація цих процесів ще більше полегшує і прискорює синтез.

2. Рестрикційний метод, або отримання генів за допомогою специфічних ендонуклеаз – рестриктаз. Ці ферменти відкриті в 1953 р. у бактерій. За допомогою рестриктаз розщеплюють ДНК бактерій іншого штаму або клітини-господаря. До теперішнього часу з різних мікроорганізмів виділено понад тисячі різних рестриктаз; в генетичній інженерії використовується близько 200.

Рестріктази гідролізують ДНК строго по певним специфічним послідовностям, званим сайтами рестрикції. Кожна з рестриктаз дізнається свій сайт рестрикції і розрізає ДНК або всередині сайту, або в безпосередній близькості від нього. Позначення рестриктаз складається з початкових літер латинської назви виду бактерії, з якої виділено фермент, і додаткового позначення, оскільки з бактерій одного виду може бути виділено декілька різних рестриктаз: Escherichia coli - Eco R1, Eco RV; Thermus aguaticus - Tag1.

З декількох типів рестриктаз в генній інженерії часто використовуються рестриктази двох типів, які дізнаються певну послідовність ДНК і гідролізують її всередині послідовності сайту рестрикції. Фрагменти ДНК, що мають однакові «липкі» кінці, можуть з'єднуватися один з одним за допомогою ДНК-лігази, при цьому сайт рестрикції відновлюється. Фрагменти з «липкими» кінцями найбільш зручні для створення рекомбінантних ДНК. Однак рестриктази не «вистригають» повністю ген і його потрібно або добудовувати хімічним шляхом, або відщеплює зайві нуклеотидні послідовності.

3. Ферментативний синтез генів став можливий після відкриття ферменту зворотної транскриптази або ДНК-ревертази (Г. Темін, Мізутані, 1970), виділеної з онкогенних вірусів. Ревертази можуть синтезувати комплементарну ланцюг ДНК (к-ДНК) на РНК-матриці. Для початку реакції синтезу ДНК-ревертазой потрібний запал у вигляді невеликого дволанцюжкового відрізка. Цю функцію виконують короткі олігонуклеотиди з 18-20 тимінових залишків (полі-Т), які з'єднуються за принципом комплементарності з полі-А-послідовністю і-РНК. В результаті утворюється гібридна і-РНК - к-ДНК молекула, причому на кінці у неї буде синтезуватися короткий відрізок дволанцюжкової ДНК – шпилька. Шпилька служить запалом для синтезу другого комплементарного ланцюга ДНК, що здійснюється вже ферментом ДНК-полімеразою (рис. 5).

 

 

Рис. 5. Схема синтезу дволанцюгової к-ДНК на м-РНК (і-РНК)

Ланцюг і-РНК гідролізується РНК-азой, а шпилька (одноланцюгова ДНК) – ендонуклеазою S1. В результаті створюється дволанцюгова молекула к-ДНК, що відповідна структурному гену, з якого транскрибувалася вихідна молекула і-РНК. До отриманої ДНК приєднують «липкі» кінці для вбудовування в плазміду і розмноження гена. Подібна схема була використана для одержання генів, що кодують інсулін, гормон росту, інтерферон, альбумін, імуноглобуліни та ін. білки, виробництво яких вже налагоджене в промислових масштабах.

Можливо і з'єднання фрагментів ДНК з «тупими» кінцями за рахунок дії ДНК-лігази, але ефективність такого «зшивання» на порядок нижче. Розроблено методи з'єднання фрагментів ДНК з «липкими» і «тупими» кінцями, що дозволяє створювати рекомбінантні молекули ДНК і в тих випадках, якщо навіть ці фрагменти були отримані з використанням різних рестриктаз.

Під рекомбінантними ДНК розуміють ДНК, утворені об'єднанням in vitro двох і більше фрагментів ДНК, виділених з різних біологічних джерел.

4. Хіміко-ферментативний синтез генів застосовується найбільш часто. Хімічним шляхом синтезують олігонуклеотиди: лінкер, адаптери, праймери, промотори, а гени синтезують ферментативним методом.

Лінкер (англ. «Iink» – з'єднувати) – короткий дволанцюговий олигонуклеотид, що містить сайти впізнавання для ряду рестриктаз.

Адаптери – це лінкери, що містять більше одного сайту впізнавання рестриктазой, він призначений для з'єднання фрагментів з несумісними кінцями.

Праймери – короткі одноланцюгові фрагменти, комплементарні початку або кінцю гена.

Промотор (80…10 нуклеотидів) – фрагмент ДНК, що розпізнається РНК-полімеразою.

Скринінг

Наступний після створення бібліотеки етап - це розшук клону (клонів), які містять необхідну послідовність ДНК. Для цього використовують три методи: гібридизацію з міченим ДНК-зондом з наступним радіоавтографічним аналізом; імунологічний скринінг (ідентифікація одиничного об’єкту шляхом перевірки чисельних об’єктів); скринінг за активністю білку, який кодується геном – мішенню.

Скринінг за допомогою гібридизації. Необхідну нуклеотидну послідовність у зразку ДНК можна виявити за допомогою ДНК-зонду, який з’єднується лише з послідовністю, що розшукується.

ДНК-гібридізація полягає в тому, що ДНК-мішень піддають денатурації (роз’єднанню ланцюгів ДНК під дією тепловій обробки або впливу лугів) і одно ланцюгові молекули міцно приєднують до твердої підложки (нітроцелюлозного або нейлонового фільтру). Потім фільтр інкубують з одно ланцюговим ДНК-зондом, який помічений радіоізотопами або іншими мітками. Якщо нуклеотидні послідовності зонду і ДНК-мішені комплементарні, то відбувається їх спарування (тобто гібридизація). Гібридні молекули можна виявити радіографічним або іншими методами. Для гібридизації необхідно, щоб на ділянці довжиною 50 нуклеотидів співпадало більш 80% з них.

Мічені ДНК-зонди для скринінгу бібліотеки можна отримати як найменш двома способами. По-перш, можна використовувати клоновану ДНК близькоспорідненого організму (гетеролітичний зонд). По друге, зонд можна отримати методом хімічного синтезу, заснованого на відомої амінокислотної послідовності білкового продукту гену, який розшукується.

Імунологічний скринінг. При відсутності ДНК-зонду можна використовувати інші методи, наприклад, якщо клонований ген здатний до експресії (реалізації генетичної інформації), то його продукт – весь білок, або його частину – можна виявити імунологічними методами. Всі клітинні лінії (клони) бібліотеці висівають на чашки з поживним середовищем. Колонії, що виросли, переносять на фільтр, клітини лізірують (руйнують), а білки, що звільнилися, фіксують на фільтрі. Потім на фільтр наносять перші антитіла, які специфічно зв’язуються з певним білком (антигеном), усі антитіла, що не зв’язалися віддаляють, а фільтр поміщають у розчин других антитіл, специфічних до перших антитіл. Часто використовують кон’югати других антитіл з ферментом, під впливом якого відбувається гідроліз субстрату з утворенням забарвленої речовини в тому місті, де здійснюється реакція.

Скринінг за активністю білку. В тому випадку, коли ген, що розшукується, кодує фермент, який не синтезується клітиної-хазяїном, використовують метод ідентифікації на чашках. Для виявлення клонів, які містять цей ген, клони Е.соІі, що складають геномну бібліотеку даного організму (клітини-хазяїна), висівають на середовищі із специфічним субстратом. Клітини, які здатні утилізувати цей субстрат, після фарбування набувають певного забарвлення.

Якщо ген, що розшукується, кодує продукт, без якого клітина-хазяїна не здатна рости на мінімальному середовищі, то бібліотеку можна створювати методом трансформації мутантних клітин. Клони, що не містять цього гену будуть гинути, а на мінімальному поживному середовищі залишаться лише клітини, до складу яких увійшов необхідний ген.

 

Завдання 2

Генна інженерія з'явилася завдяки роботам багатьох дослідників у різних галузях біохімії та молекулярної генетики. Генна інженерія – сукупність методів, що дозволяють в пробірці переносити генетичну інформацію з одного організму в інший. Перенесення генів дає можливість долати міжвидові бар'єри і передавати окремі спадкові ознаки одних організмів іншим. Ціль - отримання клітин, здатних в промислових масштабах напрацьовувати деякі білки.

1. Що представляють із себе плазміди, їх роль в генній інженерії.

2. Для чого бактеріальні клітини виробляють рестріктази?

3. Сутність процесу клонування для отримання рекомбінантної ДНК із застосуванням плазмід та рестриктаз.

4. Основні продуценти, використовувані в побудові рекомбінантних білків.

5. Поняття вектора в генній інженерії.

 

Питання для самоперевірки

1. Які Вам відомі методи отримання генів?

2. Хімічний синтез гена. Хто і коли здійснив його вперше? Які відомі Вам гени синтезовані хімічно?

3. Рестрикційні нуклеази (рестріктази). Які організми їх містять і з якою метою?

4. Що таке «липкі кінці» і «тупі кінці» ДНК?

5. Метод «вистригання» генів, його недоліки.

6. Як здійснюється ферментативний синтез ДНК?

7. Хіміко-ферментативний синтез генів.

8. Охарактеризуйте олігонуклеотиди: лінкер, адаптери, праймери і промотори.

9. Які ферменти використовуються в генній інженерії?

10. У чому суть методу полімеразної ланцюгової реакції? Хто і коли її винайшов?

11. Що таке вектор? Що використовується в якості вектора?

12. Що таке маркерний ген (ген-репортер)?

13. Яким чином клонують гени?

14. Як отримують химерні вектори-косміди?

15. Які вектори використовують для переносу генів бактерій?

16. Навіщо потрібен ori-сайт в R -плазміди?

17. Як створені ВАС і VAC вектори і яка їхня нуклеотидная ємність?

18. Як здійснюється перенесення генів у клітини-реципієнти?

19. Якими прийомами підвищують проникність плазмолеми клітини-реципієнта?

20. Які існують методи трансформації рослинних клітин?

21. Якими методами визначають що ген донора вбудувався в клітини реципієнта?

22. Як здійснюється скринінг (відбір) трансформованих клітин або бактерій?

23. Які специфічні фрагменти повинен містити вектор, щоб вбудувати ген і він був здатним до експресії в реципієнтах (бактеріях, клітинах, організмах)?

24. Які вектори частіше використовуються для клонування генів тварин і способи їх введення в клітини тварин?

 

Допоміжні операції

Пересівання мікроорганізмів

У мікробіологічної практиці постійно зустрічається необхідність перевести культуру мікроорганізмів з однієї судини в іншій. Така операція називається пересів мікроорганізмів. Пересівання роблять при виділенні чистої культури мікроорганізму, при необхідності розмножити мікроорганізми, при вивченні мікрофлори об'єктів і для освіження старої культури (рис. 6).

Пересівання мікроорганізмів слід проводити в асептичних умовах в приміщенні з чистим повітрям, краще у відгородженої частині кімнати (заскленому боксі), при найменшому русі повітря. Стіл повинен бути чистим, попередньо протертим змоченим у спирті ватним тампоном. Перед роботою необхідно ретельно вимити руки, одягнути халат.

 

 

Рис. 6. Посів культури з пробірки у пробірку

Посів культури проводиться над полум'ям спиртового пальника в умовах, що забезпечують найменшу можливість попадання сторонньої мікрофлори в поживне середовище, що засівають.

Посів проводиться бактеріальної платинової або хромонікелевої петлею, що впаяна в скляну паличку або укріплена в спеціальному тримачі. При посіві бактеріальна петля береться у праву руку за держатель, затискається між великим і вказівним пальцями і стерилізується прожаренням на полум'ї пальника (рис. 6,а). Після розжарювання докрасна петлі обпалюється весь дротик і частина утримувача, що дотикається до нею. Потім в ліву руку беруть дві пробірки (одна з культурою дріжджів, яка служить посівним матеріалом, а інша зі скошеним поживним середовищем). Пробірки тримають в похилому положенні. Мізинцем і безіменним пальцем правої руки захоплюють пробки пробірок і притискають до долоні правої ж руки; ліва рука робить обережні обертальні рухи, а права виймає пробки над полум'ям (рис. 6,б). При такому обережному витяганні пробок повинно виключатися різке входження навколишнього повітря у пробірки, що відкриваються, а разом з ним і сторонніх мікроорганізмів. Всю цю операцію проводять швидко, продовжуючи тримати в правій руці обпалену бактеріальну петлю, не торкаючись нею будь-яких предметів.
Після вилучення пробок горловини пробірок відразу ж обпалюють по колу на полум'ї пальника, потім вводять в пробірку з культурою петлю і охолоджують її, торкаючись до внутрішньої поверхні судини, після чого петлею підхоплюють шматочок або краплину посівного матеріалу (рис. 6,в).
Відібраний посівний матеріал бактеріальної петлею переносять в пробірку зі стерильним поживним середовищем (рис. 6,г). Обидві пробірки закривають над полум'ям пальника пробками (рис. 5,д). Після посіву бактеріальну петлю обов'язково обпалюють (рис. 6,е).

При пересіванні мікроорганізмів, що знаходяться у вигляді суспензії в рідкому середовищі, крім бактеріальної петлі використовують градуйовані піпетки і піпетки Пастера. Піпетки повинні бути стерильними, загорнутими у папір. При розгортанні паперу і наступних операціях не можна чіпати руками нижню частину піпетки і торкатися нею до сторонніх предметів. Робота з посівним матеріалом проводиться з дотриманням тих же правил, що і при роботі з бактеріальною петлею. Використані піпетки поміщають у дезінфікуючий розчин і повторно використовують тільки після стерилізації.

У мікробіологічної практиці для кількісних вимірювань часто працюють з суспензіями мікроорганізмів. В якості суспензійних рідин використовують стерильну водопровідну воду. Змішуючи суспензію мікроорганізмів з певним обсягом води, можна добитися необхідного розведення. Висів на щільні середовища з підготовленою суспензії роблять піпеткою, вносячи в кожну чашку із середовищем по 0,05 см³ або по одній краплі виміряного об'єму. Для кожного розведення висів здійснюють не менше ніж у три чашки, і результати вимірювань потім усереднюють.

 

Крапельний метод

Для виконання роботи попередньо готують в солодовому суслі суспензію вихідної культури дріжджів з таким розрахунком, щоб у 1 см³ середовища містилося близько 100 дріжджових клітин. З приготовленої суспензії стерильним креслярським пером наносять ряди дрібних крапель на незнежирене покривне скло, що простерилізоване в полум'ї пальника. Скло перевертають на стерильне предметне скло з лункою (препарат "висяча крапля"). Всі краплі негайно переглядають під мікроскопом і відзначають краплі, що містять по одній клітині. Якщо все краплі містять по кілька клітин, то збільшують розбавлення суспензії і процедуру повторюють. Скло з приготованим препаратом поміщають в чашку Петрі на зволожений фільтрувальний папір. Потім чашку ставлять у термостат і витримують (1...4 діб) при температурі, сприятливої для життєдіяльності даного виду дріжджів. За цей час в зазначених крапельках з одиничних клітин утворюються мікроколонії, які стерильною голкою або шматочком стерильного фільтрувального паперу за допомогою стерильного пінцета переносять в пробірку з живильним середовищем для розмноження.

 

Питання для самоперевірки

1. Що розуміють під терміном "чиста культура", "клон"?

2. Укажіть призначення чистих культур.

3. На яких прийомах засновані методи виділення чистих культур?

4. Послідовність операцій методу Дрігальського по виділенню чистих культур.

5. Чим відрізняються методи виділення чистих культур?

6. У чому полягає завершальний етап виділення чистих культур?

7. Які ознаки встановлюють при ідентифікації чистих культур?

 

Морфологія мікроорганізмів

Морфологія (від грецьких слів "морфа" – форма, «логос» – вчення) – наука про форму і будову організмів. Видові відмінності мікроорганізмів, що сформувалися в ході еволюції, включають в себе макро-і мікроморфологічні ознаки. Макроморфологічні ознаки об'єднують культуральні ознаки, тобто ознаки, що характеризують зростання культури на щільних середовищах або в рідких. Мікроморфологічні ознаки характеризують окремі вегетативні клітини (форма, розміри), а також способи вегетативного або безстатевого розмноження і утворені при цьому структури. Макроморфологічні ознаки в основному вивчають візуально, мікроморфологічні – за допомогою мікроскопа.

При описанні культур дріжджів вивчають як макро-, так і мікроморфологічні ознаки. Робота проводиться тільки на чистих культурах. Необхідно також використовувати стандартні середовища і методи культивування, так як морфологічні ознаки істотно змінюються в залежності від складу середовища і умов вирощування.

 

Фарбування препаратів

Забарвлення фіксованого препарату проводиться простими і складними методами. Простим методом забарвлення називають забарвлення препарату яким-небудь одним барвником. У складних методах фарбування проводять в декілька стадій різними барвниками. Складні методи забарвлення дозволяють вивчати структуру клітини і провести диференціацію мікроорганізмів.

У простих методах використовують барвники анілінового ряду (основні або кислотні). Для фарбування мікроорганізмів зазвичай використовують основні барвники (генціановий фіолетовий, кристалічний фіолетовий, метиленовий синій, основний фуксин), які більш інтенсивно їх фарбують у порівнянні з кислими барвниками (еритрозин, еозин, кислий фуксин). Барвники випускаються у вигляді аморфних або кристалічних порошків, з яких спочатку готують насичені спиртові розчини, а з них – ввідно-спиртові, які і використовують для фарбування.

Мікроорганізми фарбують, наносячи на певний час розчин барвника на поверхню фіксованого препарату. Наприклад, забарвлення основним фуксином ведуть 2 хв., метиленовим синім – 5...7 хв. Якщо необхідне тривале фарбування, то розчин барвника наливають у чашку Петрі, в неї поміщають предметні скла препаратами вниз на підкладені скляні палички і закривають кришкою. Після закінчення необхідного часу барвник зливають з предметного скла і промивають препарат водою до безбарвної промивної води, що стікає з поверхні скла. Потім препарат висушують на повітрі або обережно осушують фільтрувальним папером. Якщо препарат правильно пофарбований і добре промитий, то в полі зору мікроскопа він буде абсолютно прозорим з інтенсивно забарвленими клітинами.

Забарвлення за Грамом (модифікація Синьова). Згідно з методом, запропонованим Грамом в 1884 р, всі мікроорганізми поділяють на грампозитивні і грамнегативні. Забарвлення за цим методом проводять смужками фільтрувального паперу, попередньо просоченими 1%-м розчином генціанового, або кристалічного фіолетового і висушеними. На фіксований препарат накладають забарвлений папір і заливають невеликою кількістю води. Барвник розчиняється у воді і забарвлює при цьому препарат. Через 2 хв. папір видаляють пінцетом, зливають розчин барвника (але не змивають) і наносять розчин Люголя. Через 30-60 с після почорніння препарату розчин зливають, і предметне скло занурюють в етанол на 20...30 с. Знебарвлення спиртом здійснюють до зникнення фіолетових струменів фарби, після чого препарат ретельно промивають водою. Потім протягом 2 хв. забарвлюють препарат водним фуксином і промивають водою до знебарвлення промивної води.

Препарат висушують фільтрувальним папером. У грампозитивних мікроорганізмів комплекс йоду з основним фіолетовим барвником, що утворився в клітинній стінці при обробці спиртом, не вимивається і вони зберігають синьо-фіолетове забарвлення. Грамнегативні мікроорганізми при обробці спиртом знебарвлюються і легко забарвлюються фуксином в світло-червоний колір.