Застосування іммобілізованих ферментів і клітин в біотехнології

Більш широке використання ферментів до останнього часу стримувалося рядом причин, з яких найважливішими є:

- трудомісткість відділення ферментів від початкових компонентів і продуктів реакції після завершення процесу, в наслідок чого ферменти використовуються, як правило, одноразове;

- нестійкість ферментів при зберіганні, а також при різних впливах (головним чином теплових);

- трудомісткість очищення ферментів і отримання їх в достатньо активному вигляді.

Ефективність ферментативних процесів, використовуваних в самих
різних галузях людської діяльності, вдалося збільшити з
допомогою іммобілізації ферментів. Іммобілізація – це процес прикріплення ферментів до поверхні природних або синтетичних матеріалів, включення|приєднання| їх в полімерні матеріали, порожнисті волокна і мембранні капсули, поперечне хімічне зшивання. Іммобілізацію також можна характеризувати як фізичне розділення|поділ| каталізатора і розчинника, в ході якого молекули субстрату і продукту легко обмінюються між фазами.

Розділення|поділ| може бути досягнуте адсорбційним або ковалентним| зв’язуванням ферменту з нерозчинними носіями, або скріпленням|зв’язуванням| окремих молекул ферменту з|із| утворенням агрегатів. При іммобілізації| ферментів відбувається|походить| стабілізація каталітичної активності, оскільки|тому що| цей процес перешкоджає денатурації білків. Іммобілізований фермент, що має обмежену можливість|спроможність| для внутрішньоклітинних перебудов, швидше розчинного знаходить|находить| найкоротший шлях|дорогу| до функціонально активної конформації. Іммобілізовані ферменти набувають|придбавають|, окрім стабільності, окремі властивості, не характерні для їх вільного стану, наприклад, можливість|спроможність| функціонувати в неводному середовищі, ширші зони оптимуму температурі і рН|. Іммобілізовані ферменти просторово роз’єднані на носієві. Це означає утруднення міжмолекулярних взаємодій типа|типу| агрегації, які можуть викликати|спричиняти| інактивацію| ферменту. При цьому фермент з|із| розряду гомогенних каталізаторів переходить в розряд гетерогенних, тобто|цебто| знаходиться|перебуває| у фазі, не пов’язаній ні з початковим|вихідним| субстратом, ні з|із| утворюваним продуктом. Це дозволяє організовувати на базі іммобілізованих| ферментів різні ефективніші біотехнологічні процеси багаторазової періодичної, а також безперервної дії з використанням принципу взаємодії рухливої|жвавої| і нерухомої фаз.

Іммобілізовані ферменти виявляють кілька переваг над своїми розчинними аналогами:

- вони можуть бути відокремлені від продукту і використані повторно, що знижує вартість процесу;

- іммобілізовані ферменти часто виявляють підвищену
стабільність і довгостроково зберігають активність;

- вони придатні для безперервних процесів, які, в свою чергу, полегшують контроль за якістю і знижують вартість праці;

- час реакції може бути зменшений за рахунок створення більш високого співвідношення ферментів і субстратів;

- можна створювати мультиферментні системи.

Однак застосування ферментів обмежено через їх низьку стабільності, здатність каталізувати лише одну єдину реакцію, високу вартість чистих препаратів. Крім того, для практичних цілей можуть використовуватися тільки ті ферменти, для яких не потрібно регенерації кофакторів. Тому в даний час поряд з іммобілізацією ферментів увагу дослідників все більше привертає іммобілізація клітин та органел. Жива клітина на відміну від ферменту являє собою готовий біотехнологічний реактор, в якому реалізуються не тільки процеси, що призводять до утворення кінцевого продукту, але і багато інших, які сприяють підтримці каталітичної ефективності системи на високому рівні (наприклад, регенерація кофакторів). Оскільки ферменти функціонують у нативному оточенні, їх денатурація в процесі роботи зводиться до мінімуму. Це розширює число застосовуваних ферментів і дозволяє здійснювати як процеси синтезу, так і процеси деградації.

Іммобілізовані клітини ідеально підходять для використання в реакторах з перемішуванням, через які пропускають субстрат. Перевагою таких реакторів є можливість їх багаторазового використання і отримання продукту, вільного від ферменту. Звичайно, використання іммобілізованих клітин не позбавлене недоліків. Наприклад, клітинна стінка або плазматична мембрана можуть перешкоджати проникненню субстрату до ферменту або дифузії продукту з клітки. Крім того, виникає необхідність підтримання цілісності клітин і утримання їх у тій фазі росту, в якій синтезуються необхідні ферменти. Нарешті, через велику кількість присутніх в клітині ферментів (що в ряді випадків розглядається як гідність) можливе протікання небажаних побічних реакцій.

Для іммобілізації клітин використовується безліч способів (сорбція інертними і іонообмінними носіями, ковалентное зв’язування з полімерним носієм, включення в гель) і носіїв різних типів (природні та синтетичні полімери та неорганічні речовини).

 

Іммобілізація клітин Рseudomonas fluorescens в гелі альгінат кальцію

Включення живих клітин вимагає м’яких умов іммобілізації, носій при цьому повинен являти собою систему відкритих пір з хорошими умовами для газообміну. Слід брати до уваги і можливий шкідливий вплив на життєздатність клітин агентів, що здійснюють зшивання. Найбільшого поширення набуло включення клітин в поліакріламідний гель і гель альгінату кальцію.

Альгінат – основний структурний полісахарид бурих морських водоростей. У присутності моновалентних катіонів полісахарид утворює в’язкий розчин, тоді як у присутності двовалентних катіонів, особливо кальцію, спостерігається утворення гелю. Оскільки гель утворюється в м’яких умовах, в ньому можна іммобілізувати живі клітини.

План роботи

1. Здійснити іммобілізацію клітин Pseudomonas fluorescens в гель альгінату кальцію.

2. Визначити ефективність роботи каталази, оксидази і нітратредуктази у іммобілізованих клітин.

Матеріал: культура бактерій Pseudomonas fluorescen, скляні піпетки, чашки Петрі, пробірки, пінцет

Реактиви: фізіологічний розчин, 4% розчин альгінату натрію, 0,2 М розчин CaCl₂ , 1% розчин DMPA, 1% розчин NaNO₃ або КNO₃, 3% розчин Н₂О₂, 1% реактив Грісса

Хід роботи:

Включення клітин Pseudomonas fluorescens в гель альгінату кальцію проводять за наступною методикою:

• 3 мл нічної культури бактерій Pseudomonas fluorescens центрифугують 5 хв. При 7000 об/хв і ресуспендують у фізіологічному розчині (1,5 мл);

• обережно змішують 1,5 мл клітинної суспензії з 1,5 мл 4% розчину альгінату натрію;

• за допомогою скляної піпетки (об’ємом 1-2 мл) отриману суміш скопують з висоти близько 20 см в чашку Петрі з 0,2 М розчином CaCl₂;

• залишають частинки альгінату кальцію з включеними в них клітинами в розчині CaCl₂ на 5 хв. для затвердіння.

Для визначення каталази кілька сферичних частинок з іммобілізованими клітинами за допомогою пінцета поміщають в пробірку з перекисом водню (3% розчин). Ефективність роботи каталази оцінюють за інтенсивністю утворення бульбашок водню.

Визначення оксидази здійснюють з 1% розчином N’N’-диметилпарафенілендиаміндигідрохлорида (DMPA). Кілька частинок з клітинами поміщають в пробірку з DMPA і витримують при перемішуванні (37°С) 15 хв. Про наявність оксидази буде свідчити фарбування розчину в рожевий колір.

Для визначення наявності нітратредуктази кілька частинок з клітинами поміщають в пробірку з 1 мл азотнокислого натрію або калію (1% розчин).

Пробірку інкубують при перемішуванні протягом 15 хв при 37°С. Потім у пробірку вносять 1 мл реактиву Грісса (1% розчин).
Враховують реакцію на нітрити: протягом 3-5 хв. з’являється червоне забарвлення.

Питання для теоретичної підготовки

 

1. Охарактеризуйте способи іммобілізації клітин і ферментів.

2. Наведіть приклади успішного застосування іммобілізованих
клітин і ферментів в практиці.

3. Опишіть переваги та недоліки іммобілізації клітин і
ферментів в порівнянні з використанням бактеріальних культур
і очищених ферментів.

Завдання3

Відчутний внесок процеси іммобілізації ферментів і клітин внесли в тонкий органічний синтез, в аналіз, в медицину, в процеси конверсії енергії, в харчову та фармацевтичну промисловості. Вкажіть:

1. Загальні напрямки та досягнення застосування іммобілізованих ферментів у харчовій промисловості.

2. Загальні напрямки та досягнення застосування іммобілізованих ферментів в медицині.

3. Переваги іммобілізованих клітин перед іммобілізованими ферментами, перед вільними клітинами.

4. Які клітини підходять для іммобілізації? Одностадійні і поліферментні реакції.

5. Хімічні та фізичні методи іммобілізації клітин, можливості застосування.

 

Завдання 4.

Ферменти – речовини білкової природи і тому нестійкі при зберіганні. Крім того, ферменти не можуть бути використані багаторазово через труднощі у відділенні їх від реагентів і продуктів реакції. У 1916 році Дж.Нельсон і Е.Гріффін адсорбувати на вугіллі інвертазу і показали, що вона зберігає в такому вигляді каталітичну активність.

1. Винахід якого процесу впливу на ферменти з метою підвищення їх стійкості та можливості багаторазового застосування відбувся в 1916 р?

2. Переваги іммобілізованих ферментів перед нативними.

3. Основні вимоги до носіїв для отримання іммобілізованих ферментів.

4. Класифікація носіїв для отримання іммобілізованих ферментів.

5. Перерахуйте найбільш поширені носії з класу вуглеводів, відомі вам. Назвіть основні переваги і недоліки білків, при використанні їх в якості носіїв для іммобілізації ферментів.

10. Клітинна інженерія рослин

Клітинна інженерія – це один з найбільш важливих напрямків в біотехнології. Вона заснована на використанні принципово нового об’єкта – ізольованої культури клітин або тканин еукаріотичних організмів, які здатні існувати та розмножуватися на штучному поживному середовищі (in vitro). Причому клітинна інженерія більшою мірою вивчає рослинні клітини і тканини, оскільки клітини рослин здатні до регенерації і володіють унікальною властивістю – тотипотентністю, тобто здатністю утворювати цілу рослин від однієї вихідної клітини. Крім того, кожна клітина рослини зберігає всі необхідні господарсько-корисні властивості материнського організму, в результаті чого всі штучно отримані особини є копією материнської.

На сучасному етапі склалися 3 основних напрямки клітинної інженерії рослин:

1. Оздоровлення та розмноження генетично цінних рослин, при якому при культивуванні in vitro переносники систем хвороб повністю усуваються, тому цей метод виявляється дуже зручними для швидкого розмноження і зберігання рослин, які були вражені захворюваннями, особливо вірусними. У цілому від однієї меристеми можна отримати сотні тисяч рослин на рік. Крім того, даний спосіб дозволяє значно скоротити період вегетативного розвитку культивованих рослин. Так, вегетаційний період груші в лабораторних умовах скоротився з 25 років до 4 років.

2. Отримання від культивованих калюсних тканин речовин вторинного синтезу, які використовуються в медицині, парфумерії, косметиці та інших галузях промисловості. Це алкалоїди, стероїди, глікозиди, гормони, ефірні олії та ін. Наприклад, для медицини отримують такі препарати, як болезаспокійлива речовина кодеїн з маку снодійного; дигоксин, тонізуючий серцеву діяльність – з наперстянки; стимулятор – кофеїн – з рослин чаю та кави; тонізуючі речовини – з клітин женьшеню та ін.

3. Кріозберігання диких видів рослин з метою забезпечення припливу генів диких рослин сільськогосподарським сортам, що селекціонуються.

Залежно від мети використання рослинних клітин і тканин застосовується два методу культивування:

1) вегетативне клонування рослин (метод мікророзмноження);

2) культивування калюсних тканин. Таким чином, роль культури клітин і тканин величезна, а способи їх культивування є потужним інструментом розширення можливостей селекційної роботи.