Стерилізація поживних середовищ

При приготуванні поживних середовищ необхідно враховувати можливість їх інфікування сторонніми мікроорганізмами. Джерелом інфекції можуть бути навколишнє повітря, вода, компоненти поживного середовища, забруднена посуд та обладнання. Тому вживають заходів для знищення живих мікроорганізмів і запобігання їх попадання під час зберігання та проведення досліджень у поживне середовище. Обробка, при якій досягається повне звільнення від живих мікроорганізмів, у тому числі і від їх спорових форм, називається стерилізацією.

Поживні середовища знезаражують з використанням різних методів. Найбільш поширені термічні методи, при яких поживні середовища нагріваються і витримуються при певній температурі протягом часу, достатнього для стерилізації. Зазвичай поживні середовища стерилізують обробкою насиченою водяною парою під тиском в автоклавах – судинах, призначених для роботи під тиском. Поживні середовища перед стерилізацією парою під тиском (автоклавуванням) розливають у чистий посуд не більше ніж на половину її місткості і закривають ватно-марлевими пробками і паперовими ковпачками. Ємності з поживним середовищем поміщають в автоклав, в який подається водяна пара. Після видалення з автоклава повітря і заповнення його парою закривають паровий клапан і контролюють температуру і тиск в автоклаві. Тривалість обробки залежить від температури і об'єму стерилізується середовища.

Невеликі об'єми рідини (приблизно до 3000 см³) можна простерилізувати при 115...117°С (0,7 МПа) протягом 30 хв., для стерилізації великих обсягів потрібна більш тривала обробка.

Деякі компоненти поживного середовища можуть не витримати тривалу обробку при підвищених температурах (понад 100°С), тому доводиться знижувати температуру стерилізації. Однак при температурах 100°С і нижче багато спорових форм мікроорганізмів залишаються життєздатними і для їх знищення використовують дробову стерилізацію. Сутність дробової стерилізації полягає в тому, що матеріал, який стерилізується, нагрівають і витримують за певної температури протягом часу, достатнього для знищення вегетативних клітин, потім охолоджують і витримують при 18...37°С. Спорові форми при цій температурі проростають і перетворюються у вегетативні, які при повторних прогрівах загинуть. Дробову стерилізацію при 100°С проводять текучою парою, використовуючи автоклав з відкритим паровипускним клапаном. Дробова стерилізація при 60... 80°С називається тиндалізація (табл. 4).

Недоліком дробової стерилізації є можливість утворення спорових форм вегетативними клітинами, які утворились з спор, що проросли. Слід зазначити, що цей недолік можна використовувати для виділення спороутворюючих чистих культур в методі званому пастеризацією. Одноразовий нагрів при 60...80°С вбиває бесспорові мікроорганізми. Пастеризацію проводять при 60...75°С протягом 15...30 хв. або при 80°С – 10...15 хв. Іноді нагрівають до 90°С і відразу ж охолоджують. Пастеризацію широко застосовують в промисловості при переробці харчових продуктів.

Для стерилізації поживного середовища, що містить термолабільні компоненти, можна використовувати " холодну" стерилізацію ультрафільтрацією. При стерилізації ультрафільтрацією рідка середа продавлюється (0,1...1,0 МПа) через мембранний фільтр, що затримує мікроорганізми і спори. Мембранні фільтри являють собою пористі матеріали – мембрани з розмірами пор 0,01…0,1 мкм. Стерилізують їх у дистильованій воді автоклавуванням або тривалим кип'ятінням.

Смуги кладуть на стіл і загинають всередину бокові сторони або всі чотири краї так, щоб вийшла рівна стрічка шириною близько 4...5 см (в довжину пробки). Із стрічки скачують валик необхідного діаметра і відривають залишок стрічки. Правильно виготовлена ​​пробка повинна легко входити в пробірку (колбу і т.п.), щільно прилягати до її стінок, не порушуючи газообміну між вмістом пробірки і зовнішнім середовищем. Форма пробки не повинна змінюватися після витягу з посудини. Ватні пробки обтягують марлею, така ватно-марлева пробка більш зручна і має більш тривалий термін використання. Пробки готують і підбирають до судин завчасно до розливу поживного середовища і стерилізації.

 

Таблиця 4

Способи та режими стерилізації

№	Матеріал, що стерилізується	Спосіб стерилізації	Режим стерилізації	Примітка
1.	Поживні середовища: - рідкі та агарізовані, що не містять компонентів, що розкладаються при 120°С   - рідкі та агарізовані, з цукрами та іншими речовинами, що не витримують нагрівання 120°С   - сусло-агар	Автоклаву вання   Автоклаву вання   Дробова стерилізація     Автоклаву вання	120°С (0,1 МПа) 20 хв.     110°С (0,05 МПа) 15…30 хв.   Текучій пар (100°С) 30…60 хв. 3 дня поряд   115°С (0,07 МПа) 25…40 хв.	У колбах, пробірках, флаконах та ін., що закрити ватними пробками із паперовими ковпачками   Теж саме   - ʺ -     - ʺ -
2.	Колби, хімічні стакани, флакони, пробірки	Сухій жар     Автоклаву вання	160…170°С 90 хв.   120°С (0,1 МПа) 20 хв.	Теж саме     - ʺ -
3.	Чашкі Петрі, піпетки, шпателі	Сухій жар   Автоклаву вання	160…170°С 90 хв.   120°С (0,1 МПа) 30 хв.	Загорнуті у папір   Теж саме
4.	Держателі бактеріальних фільтрів, гумові пробки та шланги, фільтри Зейтца	Автоклаву вання	120°С (0,1 МПа) 20 хв.	Загорнуті у папір
5.	Мембранні фільтри	Автоклаву вання   кип’ятіння	110°С (0,05 МПа) 15 хв.   30 хв. (2…3 рази змінюють воду)	У сосуді з дистильованою водою

 

Завдання 1.

У загальному вигляді система біотехнологічного виробництва продуктів мікробного синтезу представлена ​​на схемі (рис.4).

1. Скільки стадій біотехнологічного виробництва Ви знаєте? Назвіть їх і охарактеризуйте відбуваються в них процеси.

 

Продуцент		Підготовка посівного матеріалу		Поживне середовище
		Культивування
		Розподілення
Культуральна рідина				Клітини
		Біомаса вбитих клітин		Біомаса живих клітин
Дезінтеграція вбитих клітин
Виділення и очищення метаболітів
Концентрування		Концентрування		Концентрування
Стабілізація продукту		Стабілізація продукту		Стабілізація продукту
Зневоднення		Зневоднення		Зневоднення

 

Сухий продукт

Рідкий продукт

Сухий продукт

Рідкий продукт

Сухий продукт

Рідкий продукт

 

Зберігання

Використання

Рис.4. Принципова біотехнологічна схема виробництва продуктів мікробного синтезу

2. Розкажіть про технології приготування поживних середовищ для мікробіологічного синтезу речовини. Що входить до складу поживного середовища? Особливості введення в середу джерел вуглецю.

3. Асептика при приготуванні поживного середовища в процесі мікробіологічного синтезу. Стерилізація газових і рідинних потоків. Вимоги до хімічних антисептиків.

4. Чи потребує стерилізації середовище, в якому субстратами служать метанол, етанол або концентрована оцтова кислота? Чому? Як досягається дотримання асептики в даному випадку?

 

Питання для самоперевірки

1. Перерахуйте основні стадії біотехнологічної схеми отримання продуктів мікробного синтезу.

2. Як визначити фізіологічні потреби мікроорганізмів у поживних речовинах?

3. Які методи застосовують для знезараження поживних середовищ в біотехнологічному виробництві?

4. Опишіть послідовність отримання посівного матеріалу для промислового виробництва цільового продукту.

5. Основне призначення ферментера.

6. Від чого залежить проведення стадії виділення цільового продукту?

7. Які методи застосовують для відділення біомаси клітин від культуральної рідини?

8. Що таке дезінтеграція, в яких випадках її здійснюють?

9. Розкажіть про основні методи дезінтеграції клітин.

10. У чому відмінність сепарування від центрифугування?

11. У яких випадках виконується стадія очищення цільового продукту?

12. Що таке сорбція?

 

Методи генетичної інженерії

 

У новій біотехнології частіше використовуються віруси і бактерії, рослини і тварини та їх клітини, отримані (або поліпшені) з використанням методів генетичної інженерії.

Послідовність генно-інженерних процесів наступна:

1. Отримання генів.

2. Введення гена в вектор і їх клонування.

3. Методи трансформації тваринних і рослинних клітин.

4. Скринінг - відбір бактерій або клітин, в яких вбудований ген.

5. Експресія (функціонування) генів у реципієнта.

6. Виловлювання генних продуктів з «брудної» суміші.

 

Методи отримання генів

1. Хімічний синтез. Розшифрувавши послідовність амінокислот у білку і використовуючи генетичний код, визначають послідовність нуклеотидів ДНК на ділянці гена і здійснюють його синтез з нуклеотидів за допомогою ферменту ДНК-полімераза-1. Таким шляхом в 1969 р. Корані вперше синтезував ділянку молекули ДНК, що кодує аланінову т-РНК, а в 1977 р. Бойєр синтезував ген соматостатину людини, а потім і ген інсуліну. У 1977 р. В. Гілбертом, а також Ф. Сенгером був запропонований метод секвенування, тобто розпізнавання послідовності нуклеотидів в фрагментах нуклеїнових кислот. Метод хімічного синтезу генів виявився трудомістким і малоефективним.

Потім з'явилися швидкі і прості методи синтезу порівняно довгих олігонуклеотидів з певною, заздалегідь заданою, послідовністю нуклеотидів. Тепер досить легко можна синтезувати послідовність до 100 нуклеотидів. Автоматизація цих процесів ще більше полегшує і прискорює синтез.

2. Рестрикційний метод, або отримання генів за допомогою специфічних ендонуклеаз – рестриктаз. Ці ферменти відкриті в 1953 р. у бактерій. За допомогою рестриктаз розщеплюють ДНК бактерій іншого штаму або клітини-господаря. До теперішнього часу з різних мікроорганізмів виділено понад тисячі різних рестриктаз; в генетичній інженерії використовується близько 200.

Рестріктази гідролізують ДНК строго по певним специфічним послідовностям, званим сайтами рестрикції. Кожна з рестриктаз дізнається свій сайт рестрикції і розрізає ДНК або всередині сайту, або в безпосередній близькості від нього. Позначення рестриктаз складається з початкових літер латинської назви виду бактерії, з якої виділено фермент, і додаткового позначення, оскільки з бактерій одного виду може бути виділено декілька різних рестриктаз: Escherichia coli - Eco R1, Eco RV; Thermus aguaticus - Tag1.

З декількох типів рестриктаз в генній інженерії часто використовуються рестриктази двох типів, які дізнаються певну послідовність ДНК і гідролізують її всередині послідовності сайту рестрикції. Фрагменти ДНК, що мають однакові «липкі» кінці, можуть з'єднуватися один з одним за допомогою ДНК-лігази, при цьому сайт рестрикції відновлюється. Фрагменти з «липкими» кінцями найбільш зручні для створення рекомбінантних ДНК. Однак рестриктази не «вистригають» повністю ген і його потрібно або добудовувати хімічним шляхом, або відщеплює зайві нуклеотидні послідовності.

3. Ферментативний синтез генів став можливий після відкриття ферменту зворотної транскриптази або ДНК-ревертази (Г. Темін, Мізутані, 1970), виділеної з онкогенних вірусів. Ревертази можуть синтезувати комплементарну ланцюг ДНК (к-ДНК) на РНК-матриці. Для початку реакції синтезу ДНК-ревертазой потрібний запал у вигляді невеликого дволанцюжкового відрізка. Цю функцію виконують короткі олігонуклеотиди з 18-20 тимінових залишків (полі-Т), які з'єднуються за принципом комплементарності з полі-А-послідовністю і-РНК. В результаті утворюється гібридна і-РНК - к-ДНК молекула, причому на кінці у неї буде синтезуватися короткий відрізок дволанцюжкової ДНК – шпилька. Шпилька служить запалом для синтезу другого комплементарного ланцюга ДНК, що здійснюється вже ферментом ДНК-полімеразою (рис. 5).

 

 

Рис. 5. Схема синтезу дволанцюгової к-ДНК на м-РНК (і-РНК)

Ланцюг і-РНК гідролізується РНК-азой, а шпилька (одноланцюгова ДНК) – ендонуклеазою S1. В результаті створюється дволанцюгова молекула к-ДНК, що відповідна структурному гену, з якого транскрибувалася вихідна молекула і-РНК. До отриманої ДНК приєднують «липкі» кінці для вбудовування в плазміду і розмноження гена. Подібна схема була використана для одержання генів, що кодують інсулін, гормон росту, інтерферон, альбумін, імуноглобуліни та ін. білки, виробництво яких вже налагоджене в промислових масштабах.

Можливо і з'єднання фрагментів ДНК з «тупими» кінцями за рахунок дії ДНК-лігази, але ефективність такого «зшивання» на порядок нижче. Розроблено методи з'єднання фрагментів ДНК з «липкими» і «тупими» кінцями, що дозволяє створювати рекомбінантні молекули ДНК і в тих випадках, якщо навіть ці фрагменти були отримані з використанням різних рестриктаз.

Під рекомбінантними ДНК розуміють ДНК, утворені об'єднанням in vitro двох і більше фрагментів ДНК, виділених з різних біологічних джерел.

4. Хіміко-ферментативний синтез генів застосовується найбільш часто. Хімічним шляхом синтезують олігонуклеотиди: лінкер, адаптери, праймери, промотори, а гени синтезують ферментативним методом.

Лінкер (англ. «Iink» – з'єднувати) – короткий дволанцюговий олигонуклеотид, що містить сайти впізнавання для ряду рестриктаз.

Адаптери – це лінкери, що містять більше одного сайту впізнавання рестриктазой, він призначений для з'єднання фрагментів з несумісними кінцями.

Праймери – короткі одноланцюгові фрагменти, комплементарні початку або кінцю гена.

Промотор (80…10 нуклеотидів) – фрагмент ДНК, що розпізнається РНК-полімеразою.