Завдання 1 визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків за методом дифузії в агар

У клінічній практиці слід використовувати ті лікувальні препарати, які найбільш активні щодо збудника захворювання. В обов'язок практичної бактеріологічної лабораторії входить визначення чутливості до лікувальних препаратів мікроорганізмів, виділених із організму хворого. На підставі визначення чутливості виділеного збудника до різних лікувальних препаратів вибирають оптимальний препарат для лікування хворого, а також розроблюють найбільш ефективну схему антибіотикотерапії.

При визначенні чутливості оптимальним є використання чистої культури мікроорганізмів, яку виділяють до початку антибіотикотерапії. Але в екстрених випадках для отримання орієнтовних даних допускається використання для посіву патологічний матеріал: мокротиння, кал, гній, сеча, ексудат та ін. Після виділення чистої культури мікроорганізмів дослідження повторюють.

За чутливістю до лікувальних препаратів мікроорганізми поділяють на 3 групи: чутливі, помірно стійкі й стійкі.

До чутливих відносять ті штами мікроорганізмів, ріст яких пригнічується під дією препарату в концентрації, яка створюється в сироватці крові хворого в разі використання терапевтичних доз препарату.

До помірно стійких відносять штами мікроорганізмів, для пригнічення росту яких потрібна концентрація препарату, яку можна створити при введенні його максимально допустимих доз.

Стійкими вважають штами мікроорганізмів, ріст яких не пригнічується препаратом у концентраціях, які можна створити при використанні максимально допустимих доз.

У зв'язку з тим що ступінь чутливості мікроорганізмів, залежить від умов постановки досліду, то для отримання достовірних результатів необхідно використовувати паперові диски промислового виробництва, стандартні поживні середовища й чітко дотримуватися інструкції щодо проведення дослідження.

 

Диски з антибіотиками випускають у флаконах по (100 ± 5) штук. Диски гігроскопічні, тому у флакон вкладають силікагель — індикатор синього або блакитного кольору й шар гігроскопічної вати. За наявності вологи силікагель-індикатор змінює забарвлення до бузкового або рожевого. Диски з таких флаконів використовувати не можна. Зберігають флакони з дисками в сухому темному місці за температури не вищій ніж 10 °С. Термін зберігання вказано на етикетці. Перед використанням флакони з дисками витримують за кімнатної температури протягом 1 год.

Стандартні середовища використовують трьох типів. Середовища № 1 і № 2 подібні за складом: на 1000 мл поживного бульйону додають 15 г агару (в агарі не повинно бути надлишку Са²⁺ і Mg²⁺), 3 г натрію гідрофосфату; після стерилізації рН 7,2-7,4. Ці середовища відрізняються між собою тим, що поживне середовище № 1 готують на поживному бульйоні Хоттінгера, а № 2 — на м`ясо-пептонному бульйоні (МПБ), розведеному фізіологічним розчином у відношенні 1:2.

Середовище № 3 — це сухе поживне середовище АГВ (сухе поживне середовище для визначення чутливості мікробів до антибіотиків). При його виготовленні користуються вказівками, що є на етикетці.

Для гемофільних мікроорганізмів у ці поживні середовища додають 5 % дефібринованої або гемолізованої крові. Середовище розливають по 20 мл у стерильні чашки Петрі (діаметр чашок 100 мм). Підготовлені чашки можна зберігати в холодильнику за температури 10 °С не більше ніж 7 діб. Перед посівом поверхню середовища підсушують за кімнатної температури, для цього їх витримують при злегка відкритій чашці протягом 30-40 хв.

Для посіву використовують 18-20-годинну агарову культуру бактерій або патологічний матеріал. При використанні агарової культури її спочатку змивають невеликою (4-5 мл) кількістю фізіологічного розчину натрію хлориду. Можна використати 18-20-годинну бульйонну культуру. Суспензію або бульйонну культуру розводять ізотонічним розчином натрію хлориду до густоти оптичного стандарту № 10 (1 млрд. мікроорганізмів на 1 мл суспензії), а при використанні середовища № 3 — до стандарту № 5 (500 млн. мікроорганізмів на 1 мл суспензії). Для цього суспензію чи бульйонну культуру стерильною піпеткою переносять у стерильну пробірку, яка за діаметром, товщиною стінок і кольором скла відповідає пробірці оптичного стандарту. Густоту інокулята порівнюють з густотою оптичного стандарту і в разі необхідності додають ізотонічний розчин натрію хлориду до потрібної густоти. Отриману мікробну суспензію (інокулят) розводять повторно ще в 10 разів тим самим ізотонічним розчином. Розведений інокулят в об'ємі 1-2 мл наносять піпеткою на поверхню середовища і, похитуючи чашку, рівномірно розподіляють по всій поверхні середовища; надлишок інокуляту переносять у дезінфікуючий розчин. Чашку знову підсушують за кімнатної температури протягом 10-15 хв.

За допомогою пінцета накладають диски на однаковій відстані один від одного і на відстані 2 см від краю чашки. На одну чашку — не більше 6 дисків.

Культивують мікроорганізми за температури 35-37 °С протягом 18-20 год.

Для контролю відтворення й точності результатів у випадку визначення чутливості при кожній постановці тесту паралельно зі штамами, які досліджуються, необхідно використовувати еталонні штами: Е. coli (ATCC25922), S. aureus (ATCC25923) і P. aeruginosa (ATCC27853).

Якщо діаметри зон затримки росту еталонних штамів виходять за встановлені межі, то результати визначення чутливості будуть необ'єктивними й свідчитимуть про незадовільну якість середовищ, дисків або порушення методики постановки тесту.

Проведення посіву з метою визначення чутливості мікроорганізмів до хіміопрепаратів та антибіотиків методом дифузії в агар.

Під час роботи з живою культурою обов`язково дотримувались правил техніки безпеки!

 

Алгоритм "Проведення посіву з метою визначення чутливості мікроорганізмів до хіміопрепаратів та антибіотиків методом дифузії в агар"':

поставити чашку Петрі з поживним середовищем із злегка відкритою кришкою для підсушування (на 30—40 хв), потім закрити чашку кришкою;

підготувати культуру мікроорганізмів (інокулят) до посіву;

підписати чашку Петрі (вказати назву середовища, номер аналізу, назву культури, дату посіву);

провести посів інокулята піпеткою на поживне середовище;

поставити чашку зі злегка відкритою кришкою для підсушування поверхні середовища (на 10-15 хв), потім закрити чашку кришкою;

поставити чашку донизу дном біля спиртівки;

взяти у праву руку пінцет, зафламбувати його;

взяти у ліву руку флакон з дисками, зняти з нього пробку мізинцем правої руки, зафламбувати отвір флакона;

взяти пінцетом один диск, зафламбувати отвір флакона, закрити його пробкою, поставитина стіл;

лівою рукою злегка підняти кришку чашки й покласти диск на поверхню середовища, придавити його злегка бланшами пінцета.

Чашку тримати біля полум'я на відстані не далі ніж 10 см. Пінцет фламбувати кожного разу перед тим, як узяти новий диск; при накладанні наступних дисків чашку обертати так, щоб зручно було накладати диски; дотримуватися вимог асептики];

накласти рівномірно інші диски;

поставити чашку в термостат догори дном.

На другий день лабораторного заняття зробити облік результатів дослідження за різними методами.

Методика обліку результатів дослідження.

Для визначення результатів дослідження чашки ставлять догори дном на темну матову поверхню (облік у відбитому світлі) або тримають чашку проти джерела світла (облік у світлі, яке проходить крізь чашку). Лінійкою вимірюють діаметр зони затримання росту мікроорганізмів з точністю до 1 мм, включаючи діаметр дисків. Якщо в зоні затримання росту мікроорганізмів є колонії, то це свідчить про присутність сторонньої мікрофлори або гетерорезистентність окремих штамів даної культури.

Результати оцінюють за таблицею, яка знаходиться в упаковці з дисками. У таблиці зазначено межі значень діаметрів зон затримання росту мікроорганізмів для стійких, помірно стійких і чутливих штамів у міліметрах, а також значення мінімальних пригнічуваних концентрацій (МПК) антибіотиків у мікрограмах на мілілітр розчину для помірно стійких і чутливих штамів мікроорганізмів.

Одержані значення діаметрів зон затримання росту мікроорганізмів порівнюють із зазначеними в таблиці й відносять досліджувані штами до однієї з трьох категорій чутливості, а також визначають МПК. У відповіді вказують не розмір діаметрів зон затримання росту мікроорганізмів, а ступінь чутливості штаму мікроорганізмів до лікувальних препаратів та МПК.

ДОДАТОК