Темы для реферативных сообщений. 1. Белки — положительные реактанты острой фазы воспаления.

1. Белки — положительные реактанты острой фазы воспаления.

2. Возрастная динамика белковых фракций. Эмбриоспецифические белки и их диагностическое значение.

3. Остаточный азот: его основные компоненты. Возрастная динамика уровня фракций остаточного азота.

Лабораторная работа 1.
Определение содержания остаточного азота в сыворотке крови

Актуальность

Остаточный азот является суммарным показателем безбелкового азота крови. Он складывается из мочевины (около 50 %), аминокислот (около 25 %), эрготионеина (около 8 %), креатина и креатинина (до 7,5 %), пептидов, нуклеотидов и азотистых оснований (около 5 %), мочевой кислоты (до 4%), аммиака и индикана (0,5 %). Необходимо учитывать: поскольку показатель включает различные низкомолекулярные азотсодержащие вещества, то более информативным в клинике является определение отдельных фракций остаточного азота, а не суммарного показателя.

Принцип метода

Определение содержания остаточного азота по методу Аселя основано на сжигании безбелкового фильтрата с концентрированной серной кислотой и переходе азота органических веществ в сульфат аммония, который с реактивом Несслера образует продукты желто-оранжевого цвета. Интенсивность окраски прямо пропорциональна концентрации азота.

Реактивы

1) 10% раствор ТХУ, 2) концентрированная H₂SO₄, 3) 3% раствор Н₂О₂, 4) реактив Несслера (щелочной раствор йодистых солей ртути и калия), 5) 5% раствор NaOH, 6) 26 ммоль/л стандартный раствор (NH₄)₂SO₄, 7) лакмусовая бумага.

Материал для исследования

Сыворотка крови.

Проведение анализа

Подготовительный этап выполняет лаборант: в центрифужную пробирку вносят 1,8 мл дистиллированной воды и 0,2 мл сыворотки крови, приливают 1,0 мл 10% раствора ТХУ, центрифугируют, из пробирки берут 1,0 мл надосадка и переносят в термостойкую пробирку для минерализации, приливают 3 капли концентрированной H₂SO₄ и 3 капли Н₂О₂. Осторожно упаривая жидкость, нагревают до получения бесцветного минерализата.

Цветную реакцию на остаточный азот проводят согласно таблице:

	Опыт, мл	Стандарт, мл
Минерализат	1,0	––
Стандартный раствор (NH4)2SO4	––	1,0
Раствор NaOH	добавляют по каплям, проверяя величину рН по лакмусовой бумажке, пока рН не станет нейтральной и лакмус не посинеет (излишек NaOH вызывает помутнение раствора)
Дистил. вода Реактив Несслера	8,0 2,0	8,0 2,0
	Измеряют оптическую плотность опыта и стандара против воды в кювете с длиной оптического пути 10 мм при длине волны 540 нм (зеленый светофильтр)

Расчет

Расчёт проводят по формуле:

Содержание остаточного азота [ммоль/л] =  ,

где Е_ОП и Е_СТ — оптическая плотность опытной и стандартной проб,
С_СТ — концентрация стандартногораствора.

Клинико‑диагностическое значение

Остаточный азот — это суммарный показатель состояния обмена белков. Снижениеконцентрации остаточного азота (гипоазотемия) возникает при снижении содержания мочевины, аминокислот или других его фракций.

Увеличение фракций остаточного азота (гиперазотемия) может быть абсолютной, связанной с действительным накоплением этих компонентов в крови, и относительной, связанной с дегидратацией организма. В свою очередь, абсолютная гиперазотемия может быть ретенционная (почечного и внепочечного происхождения) и продукционная.

Ретенционная азотемия возникает в результате задержки выведения азотосодержащих веществ и бывает почечного происхождения (заболевания клубочков — нефриты, туберкулез почек, нефросклероз и др.) и внепочечного происхождения. Внепочечные гиперазотемии подразделяют на надпочечные (результат нарушения гемодинамики и падения фильтрационного давления при сердечно-сосудистой недостаточности, снижении артериального давления) и подпочечные (при гипертрофии или аденоме простаты, почечно-каменной болезни).

Продукционная азотемия выявляется при всех состояниях, связанных с увеличением распада белков, от ретенционной ее отличает повышение содержания аминокислот в крови, а также одновременное накопление азотистых компонентов в крови и моче.

Оформление работы

Указывают принцип метода, записывают результаты, производят расчёты, делают вывод о возможной патологии, отмечают клинико-диагностическое значение.

Лабораторная работа 2 (теоретически).
Электрофорез белков на бумаге и ацетатцеллюлозных пленках

Принцип

Белковые молекулы, отрицательно заряженные при рН 6,8, перемещаются в электрическом поле постоянного тока по направлению к аноду. Наиболее быстро перемещаются альбумины, затем по порядку a₁‑, a₂‑, b‑ и g‑глобулины. На ход электрофореза влияет подвижность разделяемых веществ, зависящая от следующих факторов: 1) заряд (зависит от pH), размеры и форма молекул веществ; 2) электрическое поле ‑ скорость движения ионов белка прямо пропорциональна силе тока и напряжению и обратно пропорциональна сопротивлению (зависит от типа и размеров носителя и ионной силы буфера); 3) буферный раствор ‑ состав, концентрация, pH и ионная сила (зависит от концентрации присутствующих ионов и их заряда); 4) носитель ‑ учитывается его гидрофильность и адсорбция веществ на его молекулах.

Материал для исследования

Сыворотка крови.

Оборудование

1) Прибор для электрофореза, 2) денситометр.

Проведение анализа (основные положения)

Образцы сыворотки равномерно наносят по линии старта на носитель (бумага, ацетатцеллюлозная пленка). Носитель помещают в прибор для электрофореза, подают электрический ток. Буферный раствор, двигаясь в электрическом поле, захватывает молекулы белка. Молекулы с наибольшим отрицательным зарядом и наименьшим размером (альбумины) двигаются быстрее остальных, последними оказываются наиболее крупные и нейтральные (g‑глобулины). Через определённое время (устанавливают для каждого прибора индивидуально) электрофорез завершают.

Полоски бумаги/ацетатцеллюлозной пленки отмывают от буферного раствора и окрашивают. В итоге участки, содержащие белок, прокрашиваются, причём площадь и интенсивность окраски зависят от содержания белка во фракции.

В настоящее время количественный учет окрашенных зон на электрофореграмме проводят при помощи денситометра. Работа денситометра основана на пропускании луча света через движущуюся полоску носителя. При изменении интенсивности окраски носителя происходит "всплеск" и регистрируется наличие окрашенной зоны (белковой фракции). Параллельно современные приборы автоматически рассчитывают процентное соотношение белковых фракций.

Клинико-диагностическое значение

Альбумины

Снижение содержания фракции альбуминов связано с пониженным синтезом альбуминов — при врожденной анальбуминемии, белковом голодании, нарушении всасывания, тяжелых поражениях печени (цирроз, дистрофии, некроз, активный гепатит, амилоидоз печени); или с повышенным катаболизмом альбуминов — при лихорадке, кахексии, тяжелых инфекциях, панкреатите, коллагенозах, тиреотоксикозе, болезни Иценко-Кушинга (гипофункция надпочечников); или с потерей альбуминов через поверхности ожогов, почки, пищеварительный тракт; или с выходом альбумина из кровотока в межклеточное пространство при воспалительных процессах.

a -Глобулины

Повышение содержания a₁‑ и a₂‑глобулиновой фракции происходит при острых и подострых воспалительных процессах, некоторыми злхачественных опухолях, травмах, так как эти фракции содержат большинство белков острой фазы (С‑реактивный белок, церулоплазмин, гаптоглобин, a₁‑гликопротеин, a₁‑анти-трипсин, a₂‑макроглобулин).

b -Глобулины

Большая доля белков b‑глобулиновой фракции является b‑липопротеи­нами (ЛПОНП и ЛПНП), поэтому повышение этой фракции чаще всего связано с гиперлипопротеинемиями. Влияние на динамику этой фракции оказывают трансферрин, гемопексин, компоненты системы комплемента.

g -Глобулины

Содержание g‑глобулинов увеличивается при патологических состояниях, связанных с хроническими воспалительными процессами, так как класс содержит иммуноглобулины G, A, M.

Лабораторная работа 3.
Оценка альбуминовой фракции белков сыворотки крови

Реактивы

1) Рабочий раствор (бромкрезоловый зелёный в сукцинатном буфере, 2) 40 г/л стандартный раствор альбумина, 3) биуретовый реактив (раствор сульфата меди (II) и натрия гидроксида), 4) 70 г/л стандартный раствор альбумина.

Материал для исследования

Сыворотка крови.