Флуоресценция продуктов окисления адреналина

Принцип

Адреналин, окисляясь кислородом воздуха, в щелочной среде образует флуоресцирующие продукты.

Проведение анализа

К 10 каплям дистиллир. воды приливают 6 капель 10 % раствора NaOH и 2‑4 капли раствора адреналина. В свете ртутно-кварцевой лампы, наблюдают зеленую флуоресценцию продуктов окисления адреналина.

Оформление работы

Указывают принципы методов, регистрируют результаты, делают заключение о наличии адреналина в пробе, указывают его значение в организме.

Лабораторная работа 3.
Качественные реакции на белковый характер инсулина

Принцип

Инсулин ‑ простой белок, дает характерные качественные реакции: биуретовую, ксантопротеиновую, Фоля и другие неспецифичные реакции.

Материал для исследования

Раствор инсулина.

Реактивы

1) 10 % раствор NaOH, 2) 5 % раствор CuSO₄, 3) 0,5 % раствор нингидрина, 4) концентрированная HNO₃, 5) 30 % раствор NaOH, 6) 5 % раствор Pb(CH₃COO)₂, 7) 5 % раствор нитропруссида натрия.

Проведение анализа

В 5 пробирок наливают по 5 капель раствора инсулина и проделывают качественные реакции.

Реакция на пептидную связь

Пептидные связи выявляют универсальной биуретовой реакцией.

Проведение анализа

В пробирку с 5 каплями раствора инсулина вносят 3 капли 10 % раствора NаОН, 1 каплю 5 % раствора CuSО₄ и наблюдают фиолетовую окраску.

Реакция обнаружения a‑аминогрупп

Для обнаружения в инсулине a‑аминогрупп аминокислотных остатков и концевых a‑аминогрупп используют нингидриновую реакцию.

Проведение анализа

К 5 каплям раствора инсулина добавляют 5 капель 0,5 % раствора нингидрина. Пробирку кипятят до появления сине-фиолетового окрашивания.

Реакция на ароматические аминокислоты

Для обнаружения в инсулине ароматических аминокислот (фенилаланин, тирозин, триптофан) используют ксантопротеиновую реакцию.

Проведение анализа

К 5 каплям 1 % раствора инсулина вносят 2 капли конц.HNO₃, осторожно нагревают и наблюдают за появлением желтого окрашивания. При отсутствии желтого цвета добавляют еще 1‑2 капли конц.HNO₃. Далее добавляют избыток 30 % раствора NаОН и наблюдают изменение окраски на оранжевую.

Реакции на серосодержащие аминокислоты

Принцип

Сульфгидрильные группы в инсулине подвергаются щелочному гидролизу с отщеплением серы в виде Na₂S, который далее вступает в реакции: а) с ацетатом свинца дает черный или бурый осадок сульфида свинца; б) с нитропруссидом натрия дает соединение красно-коричневого цвета.

Проведение анализа

В две пробирки с 5 каплями раствора инсулина, добавляют по 5 капель 30 % раствора NaOH и кипятят 1‑2 минуты. Проводят реакции а) и б).

а) Реакция Фоля: к гидролизату добавляют 1 каплю раствора ацетата свинца и нагревают до кипения. Появляется бурый или чёрный осадок.

б) Реакция с нитропруссидом: к гидролизату добавляют 3 капли раствора нитропруссида натрия. Появляется красно-коричневая окраска.

Оформление работы

Приводят принципы методов, регистрируют результаты, делают вывод о наличии инсулина в исследуемом материале, указывают его значение в организме.

Вопросы для самоконтроля

1) Межклеточная коммуникация. Иерархия регуляторных систем организма, место гормонов, взаимосвязи. Понятие о системах эндо-, пара-, аутокринной регуляции.

2) Гормоны как первичные посредники. Разнообразие, классификации (по строению, по биологическим функциям) и характерные признаки гормонов.

3) Синтез белка и протеолиз в механизмах образования белково-пептидных гормонов. Построение, принципы получения гормонов белково-пептидной природы из предшественника проопиомеланокортина (ПОМК).

4) Реакции биосинтеза гормонов – производных аминокислот (катехоламины, тиреоиды) и холестерола (половые и кортикоидные стероиды, кальцитриолы).

5) Понятие о тканевых гормонах. Источники, причины и механизмы образования, функции. Биологически активные липиды.

6) Влияние систем гормонов и отдельных гормонов на различные виды обмена веществ и функции организма. Клетки-мишени и виды клеточной рецепции гормонов, рецепция каждого и механизм действия на клетку, гипо- и гиперфункция.

7) Причины возникновения гормональных заболеваний.

8) Направления использования гормонов в клинике. 

ТЕМА 8.2.
Строение и роль биомембран.
Механизмы транспорта и рецепции
(семинар)

Актуальность

Функциональной единицей живого является клетка. Клеточной мембране принадлежит одно из ведущих мест в поддержании жизнедеятельности клетки, формировании адекватного клеточного ответа и адаптации к требованиям молекулярного окружения и организма в целом. Каждый внешний сигнал имеет конкретную направленность и поддерживается комплексом рецепторно-эффекторных механизмов, обеспечивающих совокупную результативность клеток органов и тканей. Наличие множества регуляторных молекул различной природы определяет разнообразие механизмов передачи гормональных и иных сигналов в клетку.

Биомембрана ‑ сложная высокоорганизованная полифункциональная двумерная система, состоящая из липидов, белков и углеводного компонента. Бислойность и пластичность структуры обеспечивают глицеро‑, сфингофосфолипиды и холестерол. Функциональность мембран зависит от поверхностных и трансмембранных белков и ферментов. Белково-углеводные компоненты плазмолеммы лежат в основе контактного и рецепторного аппарата клетки, нарушения которого ведут к изменению или недостаточности эффекта гормона (сахарный диабет II типа). Клеточная мембрана участвует в механизмах эндо‑ и экзоцитоза, трансмембранном переносе веществ – пути пассивного и активного транспорта.

Моделирование биомембран путем создания липосом, нагруженных лекарственными препаратами, находит применение в фармации и медицине.

Цель

Изучение химического строения и основных функций биомембран, механизмов транспорта веществ и рецепции регуляторных молекул различной природы.

Вопросы для самоподготовки

1) Разнообразие компонентов биомембран, межмолекулярные связи и взаимодействия в составе мембран.

2) Строение, свойства и функции мембранных липидов. Значение полиненасыщенных жирных кислот и холестерола. Анулярные липиды. Липидные якоря: происхождение и назначение.

3) Белки мембран, классификации по локализации и функциям.

4) Состав, локализация и назначение углеводного компонента мембран.

5) Липопротеины, гликопротеины и гликолипиды мембран.

6) Свойства и основные функции биомембран клетки. Асимметрия липидов клеточной мембраны, функциональное значение. Флиппазы.

7) Особенности плазматической мембраны клетки и мембран органелл: ядерной, митохондриальной, лизосомальной, микросомальной и шероховатой эндоплазматической сети. Маркёрные ферменты биомембран.

8) Биохимическое обеспечение механизмов трансмембранного переноса веществ: простой и облегченной диффузии, активного транспорта, эндо- и экзоцитоза. Каналы и поры.

9) Липосомы как модельная система биомембран, их применение в фармации и медицине.

10) Характеристика основных типов рецепторов плазмалеммы, обеспечивающих передачу гормонального сигнала в клетки-мишени.

11) Характеристика мембранных механизмов передачи гормонального сигнала в клетки-мишени через рецепторы:

I типа, обладающие ферментной активностью (рецептор инсулина),

II типа, образующие ионный канал (рецептор ацетилхолина),

III типа, использующие G‑белок (компоненты передающей системы, роль активирующей/ингибирующей a‑субъединицы G‑белка):

· аденилатциклазный механизм (и гормоны, использующие его),

· Са‑фосфолипидный механизм (и гормоны, использующие его).

12) Гуанилатциклазный механизм передачи сигнала: мембраносвязанный и растворимый рецепторы. Общая характеристика и виды гуанилатциклаз. Гормоны, использующие этот механизм.

13) Связь гуанилатциклазного механизма с синтезом NO, типы NO-синтаз, реакционноспособность и биологическое значение NO, способы утилизации.

14) Строение, источники, реакции синтеза вторичных посредников передачи гормонального сигнала: цАМФ, цГМФ, ИФ₃, ДАГ, ионы Са²⁺, NO.

15) Характеристика цитозольно-ядерного механизма передачи гормональных сигналов в клетки‑мишени. Гормоны, использующие этот механизм.

16) Биологический смысл существования иерархии регуляторных систем, использующих различные механизмы передачи гормонального сигнала к компартментам клетки‑мишени.