Количественные методы в биохимии

ПО БИОХИМИИ

Учебно-методическое пособие

 

Специальность: 050102

Биология

Череповец

Рассмотрено на заседании кафедры биологии и общей экологии, протокол № 1 от 06.09.06 г.

Одобрено редакционно-издательской комиссией Физико-математического факультета ГОУ ВПО ЧГУ, протокол № 52 от 12.09.06 г.

 

 

С о с т а в и т е л ь: И.А. Непорожняя

 

Р е ц е н з е н т ы: А.С. Васильев, д-р биол. наук (ИБВВ РАН); А.В. Румянцева, канд. биол. наук, доцент (ГОУ ВПО ЧГУ)

 

Н а у ч н ы й р е д а к т о р: Н.П. Коломийцев, канд. биол. наук, доцент

 

© ГОУ ВПО Череповецкий государст-

венный университет, 2006

Введение

 

 

Данное пособие предназначено для студентов II курса специальности 050102 Биология. Пособие включает в себя следующие темы: «Белки», «Количественные методы в биохимии», «Ферменты», «Витамины», «Нуклеиновые кислоты», «Фотосинтез», «Углеводы. Липиды», «Химия молока». В пособие включены лабораторные работы, которые могут быть выполнены в течение 4 ч, отводимых для занятия.

Выполнение данных лабораторных работ будет способствовать усвоению студентами теоретического курса «Биологической химии», развитию способности к мышлению и наблюдательности, развитию практических навыков биохимического эксперимента. Теоретической основой лабораторного занятия является краткое изложение программных вопросов по данной теме, указаны объекты исследования, оборудование и реактивы, инструкция по проведению эксперимента.

В ходе выполнения лабораторной работы каждый студент заполняет протокол работы, включающий: название темы, работы, исследуемый материал, оборудование, реактивы, краткое описание хода работы, результаты исследования. Необходимые рисунки, схемы необходимо оформлять в разделе «Ход работы». По окончании каждой работы следует записывать выводы.

Лабораторные работы в данном учебном пособии подобраны с учетом технических возможностей кафедры. В конце пособия находится приложение с описанием приготовления реактивов. Лабораторные работы разработаны на основании государственного образовательного стандарта высшего профессионального образования по дисциплине «Биологическая химия». – М.: Государственный комитет РФ по высшему образованию, 2005, для специальности 050102 Биология.

 

Особенности работы в биохимической лаборатории и

инструктаж по технике безопасности

 

Приступая к выполнению практических занятий, следует изучить теоретический материал по учебной литературе, внимательно ознакомиться с содержанием очередного лабораторного занятия.

Работа с биологическим материалом (кровь, моча, слюна, желудочный сок, гомогенаты тканей) должна выполняться в меди­цинских перчатках. Следует ис­пользовать автоматические дозаторы, бюретки и мерные цилиндры. Стеклянные пипетки в области контакта со ртом перед работой обработать этанолом.

Следует использовать реагенты, маркировка которых указана на этикетке (вещество, концентрация, дата изготовления). Работа с концентрированными кислотами и щелочами, ядовитыми и огнеопасными веществами производится в вытяжном шкафу. Реагенты использовать экономно, химические реактивы необходимо брать только чистыми инструментами, после взятия необходимого количества банку с реактивом закрыть предназначенной для нее крышкой.

Все электрические приборы должны быть исправными и надежно заземленными. В рабочем состоянии крышки термостатов, сухожаровых шкафов, центрифуг должны быть закрыты. Распределительный электрический щит, к которому подключены приборы, включается только в присутствии и под контролем преподавателя.

В лабораторные центрифуги помещают парное (четное) количество тщательно уравновешенных пробирок. Ось симметрии между двумя пробирками должна проходить через ось ротора. Перед включением и в процессе работы роторная камера центрифуги должна быть закрыта. Камера может быть открыта только после полной остановки ротора.

Нельзя нагревать посуду из простого химического стекла на открытом пламени. Нагревание огнеупорных пробирок на пламени спиртовки следует производить на уровне верхней границы жидкости, при этом отверстие пробирки должно быть направлено в безопасную сторону, пробирку держат с помощью держателя. Огнеопасные вещества следует нагревать только на водяной бане (ни в коем случае не на открытом пламени!), контролируя наличие воды. Спиртовки гасить колпачком и следить за правильным положением фитиля.

Работу на измерительной аппаратуре следует производить в присутствии преподавателя или ответственного лаборанта кафедры, предварительно ознакомившись с правилами работы и техникой безопасности.

Необходимо аккуратно обращаться с лабораторной посудой, чтобы в случае ее повреждения не получить травму. О любых ситуациях, способных нанести вред здоровью, незамедлительно информировать преподавателя. После завершения работы убрать рабочее место, отключить электричество, а также убедиться, что краны с холодной и горячей водой закрыты.

 

Тема 1

БЕЛКИ

(4 ч)

 

 

Работа 1 Цветные реакции на белки и аминокислоты

Цветные реакции дают возможность обнаружить присутствие белка в биологических жидкостях и получить представление о его аминокислотном составе.

Биуретовая реакция открывает пептидную связь в белке. Её способны дать вещества, которые содержат не менее двух пептидных связей.

Нингидриновая реакция характерна для α-аминогрупп. Нингидриновая реакция используется для количественного определения α-аминокислот в аминокислотных анализаторах.

Ксантопротеиновая реакция открывает наличие в белках циклических аминокислот – триптофана, фенилаланина, тирозина, содержащих бензольное ядро.

Реакция Миллона открывает в белке циклическую аминокислоту тирозин. Белки, не содержащие тирозин, этой реакции не дают.

Реакция Фоля указывает на присутствие в белке аминокислот цистина и цистеина, содержащих слабосвязанную серу. Метионин, хотя и является содержащей серу аминокислотой, этой реакции не дает, поскольку сера в нем связана прочно.

 

Исследуемый материал:раствор яичного белка (способ приготовления дан в приложении).

Оборудование: градуированная пипетка объемом 1 мл, пипетки, мерный цилиндр – 10 мл, цилиндрические маленькие пробирки 10 шт., стеклянные палочки, пробиркодержатель, штатив, спиртовка.

Реактивы: 1) 10 % раствор NaOH; 2) 1 % раствор CuSO₄; 3) 0,5 % раствор нингидрина; 4) HNO₃ (конц.); 5) реактив Миллона; 6) реактив Фоля; 7) дистиллированная вода.

 

Ход работы

Провести цветные реакции на исследуемом растворе яичного белка. Полученные результаты оформить в виде следующей таблицы:

 

Таблица 1

 

Реагент	Количество реагента, капель
Опыт	Контроль
Биуретовая реакция
Раствор белка		-
Вода	-
NaOH, 10 %
CuSO4, 1 %
Наблюдение окрашивания

Продолжение

Нингидриновая реакция
Раствор белка		-
Вода	-
Раствор нингидрина
Кипятить 1-2 мин
Наблюдение окрашивания
Ксантопротеиновая реакция
Раствор белка		-
Вода	-
HNO3, конц.
Кипятить до появления окраски раствора белка
Наблюдение окрашивания
Реакция Миллона
Раствор белка		-
Вода	-
Реактив Миллона
Нагреть до окрашивания осадка белка
Наблюдение окрашивания
Реакция Фоля
Раствор белка		-
Вода	-
NaOH, 30 %
(CH3COO)2Pb, 5 %
Кипятить до появления окрашивания
Наблюдение окрашивания

 

Работа 2 Реакции осаждения белков

Реакции осаждения белков могут быть обратимыми и необратимыми. В первом случае белки не подвергаются глубоким изменениям, поэтому по­лучаемые осадки могут быть вновь растворены в первоначальном раствори­теле с сохранением своих нативных свойств. При необратимых реакциях осажденные белки подвергаются глубоким изменениям – денатурации.

Реакции осаждения дают возможность:

1) изучить свойства бел­ков;

2) освободить жидкость от присутствия белка;

3) установить на­личие белка в биологических жидкостях, например в моче;

4) выса­ливанием с помощью различных концентраций нейтральных солей или спиртом выделить отдельные белковые фракции.

Реакция высаливания (осаждения белков с помощью высоких концентраций нейтральных солей) обусловлена дегидратацией мак­ромолекул белка с одновременной нейтрализацией электрического заряда. Для высаливания различных белков требуется неодинаковая концентрация одних и тех же солей. Глобулины, имеющие большую молекулярную массу, легче высаливаются, чем альбумины. Глобулины осаждаются в полунасыщенном, а альбумины – в насыщенном растворе сернокислого аммония.

Осаждение белков солями тяжелых металлов (в отличие от выса­ливания) происходит при небольших концентрациях солей. Белки при взаимодействии с солями тяжелых металлов (свинца, меди, серебра, ртути и др.) адсорбируют их, образуя с ними солеобразные и ком­плексные соединения, растворимые в избытке этих солей (за исклю­чением солей AgNO₃, HgCl₂), но не растворимые в воде. Соли тяжелых металлов вызывают необратимое осаждение белков, т.е. денатура­цию.

Концентрированные минеральные кислоты вызывают денатура­цию белка. Выпадение белка в виде осадка связано с денатурацией белковых частиц и образованием комплексных солей белка с кисло­тами. Ортофосфорная кислота (H₃PO₄) осадка не дает. В избытке всех мине­ральных кислот, за исключением азотной (HNO₃), выпавший в осадок белок растворяется.

Органические кислоты вызывают необратимое осаждение бел­ков, чаще используют растворы трихлоруксусной и сульфосалициловой кислот. Кро­ме белков она осаждает также продукты их распада — высокомолеку­лярные пептоны и полипептиды. Трихлоруксусная кислота способна осаждать только белки и не осаждает продукты распада белков.

В органических растворителях (этанол, ацетон и др.) белки не рас­творяются и выпадают в осадок. В зависимости от природы белка для его осаждения требуются различные концентрации спирта. Этанол свя­зывает воду, вызывая дегидратацию мицелл белка и неустойчивость их в растворе. При осаждении этанолом раствор белка должен быть нейт­ральным или слабокислым, но не щелочным. Реакция облегчается при­сутствием электролита хлористого натрия вследствие снятия заряда с частиц белка. Реакция осаждения белка этанолом или кратковремен­ным действием этанола обратима при охлаждении. Если осадок быстро отделить от этанола, то белок может сохранить нативное состояние.

Осаждение белков алкалоидными реактивами также относится к необратимым реакциям. К группе алкалоидных реактивов принад­лежат танин, пикриновая кислота и др. Механизм осаждения белков алкалоидными реактивами связан с образованием нерастворимых солеобразных соединений с основными азотсодержащими группами белка. Белки – протамины и гистоны, несущие положительный за­ряд, хорошо осаждаются алкалоидными реактивами в нейтральной среде без подкисления.

Исследуемый материал:раствор яичного белка (способ приготовления дан в приложении).

Оборудование: градуированная пипетка объемом 1 и 5 мл, пипетки, мерный цилиндр – 10 мл, цилиндрические маленькие пробирки 15 шт., стеклянные палочки, спиртовка, воронка, фильтровальная бумага, штатив для пробирок, пробиркодержатель.

Реактивы: 1) 1 % раствор СН₃СООН; 2) 10 % раствор NaOH; 3) NaCl (порошок); 4) насыщенный раствор NaCl; 5) (NH₄)₂SO₄ (порошок); 6) насыщенный раствор (NH₄)₂SO₄; 7) 10% раствор CuSO₄; 8) 5 % раствор (CH₃COO)₂Pb; 9) HNO₃ (конц.), H₂SO₄ (конц.); 10) 10 % раствор трихлоруксусной кислоты; 11) 20 % раствор сульфосалициловой кислоты; 12) насыщенный раствор пикриновой кислоты, дистиллированная вода.

 

Ход работы

Провести реакции осаждения белка различными способами.

 

Опыт 1. Осаждение белков кипячением

 

Таблица 2

Номер пробы	Раствор белка, капель	Ход анализа	Результат	Вывод
		Нагреть до кипения
		Нагреть до кипения + 1капля раствора СН3СООН
		5 капель раствора СН3СООН + кипячение
		5 капль раствора СН3СООН + 2 капли насыщенного раствора NaCl + кипячение
		2 капли раствора NaOH + кипячение

 

 

Опыт 2. Осаждение белков при комнатной температуре нейтральными солями – высаливание

Таблица 3

Реагенты, условия опыта	Количество реагента, мл
Опыт А	Опыт Б
Раствор белка
NaCl, порошок	До насыщения	-
(NH4)2SO4, насыщенный раствор	-
Отфильтровать	Через 10 мин на фильтре глобулины	Без инкубации на фильтре глобулины
Исследуется фильтрат
(NH4)2SO4, порошок	-	До насыщения
Результат	Исследуется после кипячения

 

Во втором варианте после осаждения альбуминов надосадочную жидкость проверяют на отсутствие белка с помощью биуретовой реакции.

 

Опыт 3. Осаждение белков солями тяжелых металлов

К 5 каплям раствора яичного белка осторожно прибавить 1 каплю раствора сульфата меди (II). Образуется бледно-голубой осадок, нерастворимый в воде. К другой такой же порции раствора белка прилить вначале 1 каплю раствора сульфата меди (II), а затем еще 10 капель и наблюдать растворение осадка в избытке реактива. К 5 каплям раствора яичного белка прибавить 2 капли раствора ацетата свинца (II), образуется осадок, нерастворимый в воде, но легко растворяющийся в избытке осадителя.

 

Опыт 4. Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами.

К 5 каплям концентрированной азотной кислоты осторожно по стенке пробирки прилить 5 капель раствора белка так, чтобы обе жидкости не смешивались. На границе двух жидкостей образуется осадок в виде небольшого белого кольца (проба Геллера). Осторож­но встряхнуть пробирку и добавить избыток азотной кислоты: оса­док не исчезает, так как в избытке азотной кислоты он не растворя­ется. Осаждение серной кислотой проводится аналогично реакции с азотной кислотой. К 5 каплям концентрированной серной кисло­ты осторожно по стенке пробирки прилить 5 капель раствора белка. Образуется осадок, растворимый в избытке серной кислоты (при встряхивании).

 

Опыт 5. Осаждение белков органическими веществами:

а) органическими кислотами: к 5 каплям раствора белка добавить 2 капли раствора сульфосалициловой кислоты. Выпадает осадок бел­ка. К 5 каплям раствора белка добавить 2 капли раствора трихлоруксусной кислоты. Выпадает осадок белка;

б) спиртом: к 5 каплям раствора белка прилить 15-20 капель этанола. Раствор мутнеет. Добавить 1 каплю насыщенного раствора хлористого натрия. Наблюдается выпадение осадка;

в) алкалоидными реактивами: к 5 каплям раствора белка добавить 2 капли насыщенного раствора пикриновой кислоты и 2 капли рас­твора уксусной кислоты. Выпадает осадок белка.

 

 

Тема 2

Ход работы

Наливают 15-20 мл исследуемого раствора в целлофановый ме­шочек и погружают его в стакан с дистиллированной водой таким образом, чтобы открытый край мешочка выступал над поверхностью воды. Через 1 ч с водой из стакана и раствором белка, содержащим примесь углеводов, проделывают биуретовую реакцию (на белок) и реакцию Феллинга (на глюкозу), чтобы убедиться в отсутствии белка и наличии глюкозы в воде из стакана.

Биуретовая реакция. К 5 каплям исследуемого раствора приба­вить 3 капли 10 % раствора гидроксида натрия и 1 каплю 1 %раствора сульфата меди (II), перемешать. Содержимое пробирки приобретает си­не-фиолетовый цвет, что указывает на присутствие белка в растворе.

Реакция Феллинга. К 5 каплям исследуемого раствора прибавить 5 капель феллинговой жидкости и нагреть. Наблюдается образование оксида меди (I) красного цвета (Cu₂O), что указывает на присутствие глюкозы в растворе.

Работа 6 Методы количественного определения белка на примере биуретовой реакции

 

Для количественного определения белков применяют физи­ческие, химические и биологические методы.

Наибольшее распространение из физических методов количе­ственного определения белков получили три: рефрактометриче­ский (по показателю преломления белковых растворов), спектрофотометрический (по поглощению в ультрафиолетовой обла­сти спектра) и полярографический (по кривым, показывающим зависимость между силой тока и напряжением, приложенным к системе, содержащей белок). Пикнометрический метод (по плот­ности белковых растворов) употребляется редко.

Химические методы количественного определения белков разнообразны. Наиболее простым химическим методом опреде­ления белка является количественное определение общего или белкового (после осаждения белка и отделения его от раство­римых азотсодержащих веществ) азота. Умножая величину процентного содержания общего азота на коэффициент 6.25 (среднее содержание азота в белках – 16 %, отсюда 100:16 = 6.25), получают данные о содержании сырого протеина. Про­делывая ту же операцию с величиной, характеризующей содер­жание белкового азота, получают данные о количестве белка. Эти способы условны, так как дают приблизительную оценку о количестве белка.

Биологические методы количественного определения белков применимы лишь к белкам, обладающим ферментативной и гормональной активностью. Измеряя степень биологической ак­тивности препарата, можно составить представление о содержа­нии в нем белка, обладающего данной активностью. Этот метод тоже не дает абсолютных результатов.

Самым распространенным химическим методом количествен­ного определения белков является колориметрический метод. Он основан на измерении интенсивности окраски цветных реакций, раз­вивающихся при взаимодействии белков с тем или иным специ­фическим реагентом. Чтобы рассчитать концент­рацию белка, в этом случае строят калибровочный график.

Биуретовый метод основан на способности растворов белка давать фиолетовое окрашивание при взаимодейст­вии с раствором сульфата меди в щелочной среде. Интен­сивность окраски пропорциональна концентрации белка в растворе.

Материал для исследования: растворы яичного белка концентрации 5, 10 и 15 мг/мл, и раствор белка неизвестной концентра­ции.

Оборудование: штативы с пробирками; бюретки для биуретового реактива; склянки с растворами белка; пи­петки на 1 мл; ФЭК с кюветами с толщиной слоя 1 см, миллиметровка.

Реактивы: биуретовый реактив.

 

Ход работы

1. В первые 3 пробирки помещают стандартные растворы с содержанием белка 5, 10 и 15 мг в 1 мл. Эти пробирки служат для построения ка­либровочной кривой. В четвертую пробирку наливают раствор с неизвестной концентрацией белка, которую нужно опре­делить.

2. В каждую пробирку добавляют по 4 мл биуретового реактива. Содержимое пробирок хорошо перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 20 мин для раз­вития окраски. Окрашенные растворы колориметрируют на ФЭКе в кюветах с толщиной слоя 1 см, пользуясь зе­леным светофильтром (длина волны 540 нм). В качестве контрольного раствора при измерении на ФЭКе исполь­зуют биуретовый реактив.

3. Строят калибровочный график, откладывая на оси абсцисс концентрации стандартных растворов белка, а на оси ординат - соответствующие – значения оптической плотности. Зная оптическую плотность раствора белка с неизвестной концентрацией, по калибровочной кривой определяют в нем содержание белка.

Записывают принцип метода; зарисовывают калибро­вочный график зависимости оптической плотности от концентрации стандартного раствора белка. Пользуясь этим графиком, рассчитывают содержание белка в испы­туемом растворе и записывают результат.

 

Тема 3

ФЕРМЕНТЫ

(4 ч)

Работа 7 Ферменты как биологические катализаторы

 

Ферменты, энзимы – специфические белки всех живых клеток, играющие роль биологических катализаторов. С их помощью осуществляется обмен веществ и энергии в организмах.

Свойства ферментов:

1. Все ферменты белковой природы (простые и слож­ные).

2. Все ферменты характеризуются термолабильностью, т.е. оптимум дей­ствия 0- 45 °С.

3. Ферменты специфичны; различают абсолютную и от­носительную специфичность.

4. Ферменты действуют в мягких условиях среды, с определенным значением рН.

5. Ферменты обладают высокой каталитической актив­ностью (например, холинэстераза за 1 с расщепля­ет 300 000 молекул ацетилхолина).

 

Исследуемый материал: раствор слюны.

Оборудование: пипетки, мерный цилиндр – 50 мл, цилиндрические маленькие пробирки 15 шт., стеклянные палочки, штатив для пробирок, химический стакан, пробиркодержатель, спиртовка, спички.

Реактивы: 1) 1 % раствор крахмала; 2) 10 % раствор NaOH; 3) 1 % раствор CuSO₄; 4) фосфатный буфер; 5) 1 % раствор NaCl; 6) водный раствор I₂ в КI.

 

Ход работы

Для исследования активности амилазы слюны и ее свойств используют собственную слюну, разведенную в 10 раз. Для этого в мерную пробирку собирают 1 мл слюны (предварительно полость рта ополаскивают водой) и доводят до метки 10 мл.

 

Опыт 1 .Определение термолабильности амилазы слюны.

Таблица 4

Реагенты, условия опытов	Количество реагента, капель
Опыт А	Опыт Б	Контроль
Раствор слюны		-	-
Кипяченая слюна (кипятить 2 мл раствора слюны 5-8 мин, охладить)	-		-
Вода	-	-
Крахмал
Термостат, 38 ºC, 10 мин
Реакция с иодом (5 капель раствора из пробирки + 1капля I2 в КI), окраска
Реакция Троммера (5 капель раствора из пробирки + 5 капель 10 % NaOH + 3 капли 1 % CuSO4, кипятить 1 мин), окраска
Вывод:

 

Таблица 5

Опыт 2. Влияние температуры на скорость ферментативной реакции.

Реагенты, условия опытов	Проба 1	Проба 2	Проба 3	Проба 4
Крахмал, мл
Раствор слюны, мл
Температура, ºC
Инкубировать 10 мин и затем добавить по 1-2 капли I2 в КI
Зарегистрировать окрашивание

Таблица 6

 

Опыт 3. Определение оптимума рН для действия амилазы.

 

Реагенты	Условия опытов
Значение рН
6.0	6.4	6.8	7.2	7.6	8.0
Буферный раствор, мл
Крахмал, 0,5 %, мл
Раствор слюны, мл
Термостат, 38 ºC, 10 мин
Раствор I2 в КI, капель
Окраска
Вывод:

 

Таблица 7

Опыт 4. Влияние активаторов и ингибиторов на активность амилазы.

 

Реагенты, условия опытов	Количество реагента
Проба 1	Проба 2	Контроль
Раствор слюны, мл
Вода, капель	-	-
NaCl, капель		-	-
CuSO4 , капель	-		-
Крахмал, капель
Экспозиция, 5 мин
Раствор I2 в КI, капель
Результат, окраска
Вывод:

 

Работа 8 Свойства ферментов

Исследуемый материал: раствор слюны, срезы клубней вареного и сырого картофеля.

Оборудование: пипетки, мерный цилиндр – 50 мл, цилиндрические маленькие пробирки 10 шт, стеклянные палочки, штатив для пробирок, химический стакан, пробиркодержатель, спиртовка, спички.

Реактивы: 1) 1 % раствор крахмала; 2) Феллингова жидкость, 3) 1 % раствор сахарозы; 4) гваяковая настойка; 5) NaI (порошок); 6) NaCl (порошок); 7) КClO₃ (порошок); 8) фильтрат дрожжей.

 

 

Ход работы

 

 

Опыт 1 .Специфичность действия ферментов

Для действия ферментов характерна специфичность:

а) абсо­лютная – фермент катализирует превращение строго определенного вещества (уреаза расщепляет только мочевину на СО₂ и NH₃);

б) относительная – фермент катализирует превращения одного типа свя­зей в ряду близких по химическому строению веществ (например, липаза катализирует разрыв сложноэфирных связей независимо от типа радикала);

в) групповая относительная – то же, но для разрыва связи важны образующие ее атомные группировки. Все протеолитические ферменты расщепляют пептидные связи, но пепсин, трипсин и химотрипсин расщепляют пептидные связи, образованные только определенными аминокислотами;

г) стереохимическая – фермент катализирует превращение только одного стереоизомера при наличии рацемата (L-оксидазы превращают L-аминокислоты, но не D-аминокислоты).

 

Приготовить раствор слюны: 1мл слюны + 4 мл воды.

Таблица 8

Реагенты, условия опытов	Количество реагента, капель
Проба 1	Проба 2	Проба 3	Проба 4
Раствор слюны			-	-
Фильтрат дрожжей	-	-
Крахмал		-		-
Сахароза	-		-
Термостат, 37 ºC, 10 мин
Реакция Феллинга (по 5 капель раствора из каждой пробирки + 3 капли реактива Феллинга, кипятить 1 мин), окраска
Вывод:

 

Опыт 2. Исследование свойств фермента тирозиназы из картофеля

Тирозиназа – фермент, окисляющий аминокислоту тирозин в темный пигмент за счет кислорода. Этот фермент может окислить и гвоякову смолу. В результате образуется озонид синего цвета.

Таблица 9

Реагенты, условия опытов	Срез сырого картофеля	Срез вареного картофеля
Гваяковая настойка, капель
Результат
Вывод

Опыт 3. Ингибирующее действие хлорид-ионов на дегидрогеназный комплекс картофеля.

Хлорид-ионы ингибируют дегидрогеназный комплекс, и в их присутствии поверхность среза картофеля остается без изменений; в остальных случаях она темнеет.

 

Таблица 10

 

Срезы клубней картофеля	Нанесение порошка	Результат, окраска (15-20 мин)	Вывод
	-
	NaCl
	NaI
	КClО3

 

Тема 4

ВИТАМИНЫ

 

(8 ч)

 

Работа 9 Качественные реакции на витамины

Витамины – это низкомолекулярные органические соединения различной химической природы, необходимые для осуществления жизненно важных биохимических и физиологических процессов в живых организмах. При этом витамины не используются для пластических и энергетических нужд организма. Человек в сутки потребляет око­ло 600 г пищи (в пересчете на сухое вещество), из этого количества на долю витаминов приходится 100-200 мг. В настоящее время существует несколько номенклатур витаминов:

1) по предложению Э. Мак-Коллума (1913), их обозначают латинскими буквами А, В, С, D, Е, К и др.;

2) наименование по физиологическому действию — к названию болезни, которую предупреждает или излечивает витамин, до­бавляется приставка aнmu- (антискорбутный, антигеморрагический, антистерильный и др.);

3) химическое наименование.

В 1974 г. принята временная классификация витаминов.

Витамины, растворимые в воде:В₁ – тиамин, антиневротичес­кий; В₂ – рибофлавин, витамин роста; В₃ – пантотеновая кислота, антидерматитный; В₅ (РР) – никотиновая кислота, антипеллагрический; В₆ – пиридоксол, антидерматитный; В₁₂ – цианкобаламин, антианемический; В_с – фолиевая кислота, антианемический; Н – биотин, антисеборейный; С – аскорбиновая кислота, антискорбут­ный; Р – рутин, капилляроукрепляющий.

Витамины, растворимые в жирах:А – ретинол, антиксерофтальмический; D – кальциферол, антирахитический; Е – токоферол, антистерильный; К – филлохинон, антигеморрагический.

Витаминоподобные вещества:холин, липоевая кислота, оротовая кислота, витамин В₁₅, инозит, ПАБК (парааминобензойная кисло­та), карнитин, витамин U.

Биологическое действие большинства витаминов сводится к уча­стию их в ферментативных реакциях в качестве кофакторов фермен­тов (коферментная функция). Для витаминов, растворимых в воде, известны антивитамины. Это аналоги витаминов, которые оказывают противоположное витаминам действие (например, антивитами­ном тиамина является окситиамин). Среди жирорастворимых вита­минов антивитамины известны только к витамину К – производные кумарина (дикумарин, варфарин, тромексан).

Недостаточное поступление витаминов с пищей вызывает забо­левания, называемые гиповитаминозами. При отсутствии одного из витаминов в пище развивается авитаминоз, при недостатке несколь­ких – полигиповитаминозы, а при их отсутствии в пище – полиави­таминозы. При чрезмерном введении витаминов (как правило, жи­рорастворимых) могут развиваться гипервитаминозы.

 

Исследуемый материал:фармакопейные препараты витаминов А, С, Е, D, Р, В₁, В₆, В₁₂, викасола.

Оборудование: пипетки, мерный цилиндр – 10 мл, цилиндрические маленькие пробирки 10 шт., стеклянные палочки, штатив для пробирок, пробиркодержатель, спиртовка, спички, воронка, фильтровальная бумага, химический стакан, флюороскоп.

Реактивы:

1) H₂SO₄ (конц.), 23 % раствор хлороформа, 5 % раствор FeCl₃;

2) анилиновый реактив (15 частей анилина и 1 часть HCl (конц.)), 23 % раствор хлороформа;

3) раствор цистеина – 0.25 г/л, раствор NaOH – 100 г/л, раствор викасола – 0.5 г/л;

4) HNO₃ (конц.), сахароза (порошок), 1 %раствор FeCl₃;

5) 10 % раствор NaOH, 10 % раствор HCl, 5 % раствор K₄[Fe(CN)₆]; 1 %раствор FeCl₃, 0.01 % раствор метиленового синего, 10 % раствор Na₂CO₃, раствор Люголя (0.1 % раствор иода в рас­творе йодистого калия);

6) 1 % раствор FeCl₃, рутин, насыщенный раствор, H₂SO₄ (конц.), 0.5 % раствор HCl, феллингова жидкость, 10 % раствор NaOH;

7) диазореактив – 5 капель 1 % раствора сульфаниловой кислоты + 5 капель 5 % раствор NaNO₂, 10 % раствор Na₂CO₃;

8) HCl (конц.), Zn (мет.);

9) 1 %раствор FeCl₃;

10) H₂SO₄ (конц.), 30 % раствор NaOH, 10 % раствор тиомочевины.

 

Ход работы

Провести качественные реакции на витамины А, С, Е, D, Р, В₁, В₆, В₁₂.

 

Опыт 1. Качественные реакции на витамин А

Реакция на витамин А с концентрированной серной кислотой. В су­хую пробирку вносят 1 каплю раствора витамина А и 5 капель раствора хлороформа, перемешивают и добавляют 1 каплю концентрирован­ной серной кислоты. Реакцию проводить в вытяжном шкафу! Отмечают результат реакции.

Реакция на витамин А с хлорным железом. В сухую пробирку вно­сят 1 каплю витамина А и 5 капель раствора хлороформа. Перемешива­ют, добавляют 3 капли хлорида железа. Реакцию проводить в вытяжном шкафу! Отмечают результат реакции.

 

Опыт 2. Качественные реакции на витамин D

В сухую пробирку вносят 2 капли витамина D, 10 капель раствора хлорофор­ма и 1-2капли анилинового реактива, осторожно нагревают при постоянном помешивании. Реакцию проводить в вытяжном шкафу! Отмечают результат реакции.

 

 

Опыт 3. Качественная реакция на викасол

К 5 каплям раствора викасола добавляют равное количество рас­твора цистеина и 1 каплю раствора едкого натра. Отмечают результат реакции.

 

Опыт 4. Качественные реакции на витамин Е

Реакция с азотной кислотой. В сухую пробирку вносят 6 капель ви­тамина Е, добавляют несколько крупинок сахарозы. Осторожно по стенке пробирки прибавляют 10 капель концентрированной азотной кислоты. Реакцию проводить в вытяжном шкафу! Отмечают результат реакции.

Реакция с хлорным железом. В сухую пробирку вносят 0,5 мл ви­тамина Е, затем 0,5 мл раствора хлорного железа (III) и тщательно перемешивают содержимое пробирки. Отмечают результат реакции.

 

 

Опыт 5. Качественные реакции на витамин С

Реакция с железосинеродистым калием K₄[Fe(CN)₆]. В две пробирки вносят по 1 капле раствора NaOH и по 1 капле раствора железосинеродистого калия. В одну пробирку добавляют 5 капель раствора вита­мина С, в другую — столько же воды. Перемешивают, добавляют по 3 капли раствора соляной кислоты и по 1 капле раствора хлор­ного железа. В пробирке с витамином С образуется осадок берлинской лазури, в контрольной пробирке наблюдается бурое окрашивание, обусловленное образованием железосине-родистой соли окиси железа.

Реакция с метиленовым синим. В две пробирки вносят по 1 кап­ле раствора метиленового синего, по 1 капле раствора соды. В одну из них добавляют несколько капель раствора аскорбино­вой кислоты, в другую – 1 мл воды. В пробирке с аскорбиновой кислотой происходит обесцвечивание метиленового синего (при нагревании).

Реакция с раствором Люголя. В две пробирки вносят по 10 капель дистиллированной воды и по 2 капли раствора Люголя. В одну про­бирку прибавляют – 10 капель дистиллированной воды, в другую -10 капель раствора аскорбиновой кислоты. В пробирке с аскорбино­вой кислотой раствор Люголя обесцвечивается в результате восста­новления йода до йодистоводородной кислоты.

 

Опыт 6. Качественные реакции на витамин Р

Реакция с хлоридом железа. Хлорид железа образует с рутином комплексное соединение, окрашенное в изумрудно-зеленый цвет. К 12 мл насыщенного водного раствора рутина прибавляют не­сколько капельраствора хлорида железа. Отмечают результат реакции.

Реакция с концентри