Ткани селезенки, печени, мышц

 

Дезоксирибонуклеопротеины содержатся преимуще­ственно в ядрах клеток, в то время как рибонуклеопротеины преобладают в цитоплазме. Дезоксирибонуклеопротеины хорошо растворяются в щелочных и солевых растворах и выпадают в осадок при нейтрализации ще­лочных растворов и при разведении водой солевых рас­творов.

Исследуемый материал:ткани селезенки, печени, мышц курицы или рыбы.

Оборудование: ступка с пестиком, марля, центрифуга, штатив, пробирки, деревянные палочки, спиртовка, спички, воронка, 2 химических стакана, лакмусовая бумага, весы, разновесы, обратный холо­дильник, электроплитка.

Реактивы:1) песок; 2) 1 М раствор NaCl; 3) 0,4 % раствор NaOH; 4) 10 % раствор H₂SO₄; 5) 10 % раствор NH₃; 6) дифениламин; 7) аммиачный раствор серебра; 8) реактив для биуретовой реакции; 9) 10 % раствор уксусной кислоты; 10) молибденовый реактив.

 

Ход работы

3 г селезенки (печени, мышц) растирают в ступке с 0,6 г песка, затем небольшими порциями добавляют в ступку 1 М раствор хлористого натрия, растирая содержимое в течение 15-20 мин.

Полученный вязкий раствор процеживают через мар­лю в химический стакан, переносят в центрифужные пробирки, урав­новешивают их и центрифугируют в течение 10-15 мин. Соблюдать все правила работы с центрифугой! Измеряют объем полученного центрифугата, отмеряют 5-кратный объем воды (по отношению к центрифугату), подкисленный уксусной кислотой до рН = 4.5, в стакан и, медленно вращая в нем деревянную палочку, вливают цен­трифугат.

Нерастворимый в воде дезоксирибонуклеопротеин выпадает в осадок и наматывается в виде нитки на дере­вянную палочку. Нити дезоксирибонуклеопротеина вы­нимают вместе с палочкой и переносят в чистую пробир­ку. Эту часть дезоксирибонуклеопротеина используют для обнаружения дезоксирибозы дифениламиновой пробой. Для этого содержимое пробирки растворяют в 10 каплях раствора гидроксида натрия и прибавляют 10 капель дифениламинового реактива. После 10-минутного нагревания в кипящей водяной бане жидкость в пробирке приобрета­ет синее окрашивание.

Остальную часть выделившегося в виде осадка нуклеопротеина отделяют центрифугированием, переносят и пробирку, прибавляют 5 мл раствора серной кис­лоты и закрывают пробирку пробкой с обратным холо­дильником. Осторожно нагревают пробирку в течение часа, держа ее на расстоянии от спирали электроплитки. Время нагревания отмечают с момента закипания рас­твора.

Гидролизат после охлаждения отфильтровывают и проводят ряд реакций. Белок и полипептиды обнаружи­вают биуретовой реакцией. Для обнаружения пуриновых оснований к 1 мл гидролизата прибавляют 5-6 капель раствора аммиака до щелочной реакции по лакмусу и до­бавляют 0,5 мл аммиачного раствора серебра. Образуется хлопьевидный осадок серебряных солей пуриновых осно­ваний, который постепенно оседает на дно.

Фосфорную кислоту обнаруживают фосфорно-молибденовой пробой по появлению желтого осадка фосфорно-молибденовокислого аммония. К 0,5 мл гидролизата прибавляют равный объем мо­либденового реактива и кипятят несколько минут. Жид­кость окрашивается в лимонно-желтый цвет. При охлаж­дении образуется желтый осадок фосфорно-молибденовокислого аммония.

 

 

Работа 15 Извлечение нуклеопротеинов дрожжей

 

Для изучения химического состава нуклеопротеинов удобно пользоваться дрожжевыми клетками. При непро­должительном гидролизе дрожжевой массы или выделен­ных из нее нуклеопротеинов, последние (нуклеопротеины) распадаются на полипептиды, пуриновые и пиримидиновые основания, рибозу и дезоксирибозу и фосфорную кислоту. Продукты гидролиза могут быть обнаружены в гидролизате качественными для каждого вещества ре­акциями.

 

Исследуемый материал:прессованные дрожжи.

Оборудование: ступка с пестиком, марля, центрифуга, штатив, пробирки, деревянные палочки, спиртовка, спички, воронка, 2 химических стакана, лакмусовая бумага, стеклянный песок.

Реактивы: 1) диэтиловый эфир; 2) 0.4 % раствор NaOH; 3) 10 % уксусная кислота.

 

Ход работы

 

Извлечение нуклеопротеинов из дрожжей. В фар­форовую ступку помещают 1 г дрожжей, добавляют 1 каплю диэтилового эфира, 2 капли дистиллированной воды, около 0,1 г стеклянного песка. Дрожжевую массу растирают пестиком 1-2 мин для разрушения клеток. В ступку добавляют 4 мл раствора гидроксида натрия и растирание продолжают в течение 5 мин. Содержимое ступки пипеткой переносят в центрифужную пробирку, уравновешивают на весах с другой пробиркой, в которую налита вода, и центрифугируют в течение 10 мин. Надосадочную жидкость переносят пипеткой в стакан с 80-90 мл воды, подкисленной до рН = 4.5 уксусной кислотой. Выпавший осадок РНК-протеина отделяют центрифугированием.

 

 

Работа 16 Изучение химического состава

Рибонуклеопротеинов дрожжей

Исследуемый материал: прессованныедрожжи.

Оборудование: коническая колба 150 мл, ступка с пестиком, марля, центрифуга, штатив, пробирки (маленькие и большие), деревянные палочки, спиртовка, спички, воронка, 2 химических стакана, лакмусовая бумага, весы, разновесы, водяная баня, обратный воздушный холодильник.

Реактивы: 1) 10 % раствор H₂SO₄; 2) 10 % раствор NaOH, 1 % раствор CuSO₄; 3) 10 % раствор NH₃; 4) аммиачный раствор серебра; 5) мо­либденовый реактив.

Ход работы

 

200 мг дрожжей помещают в широкую пробирку и добавляют 5 мл 10 %-го раствора серной кислоты и 5 мл дистиллированной воды. Перемешивают и закрывают пробкой с обратным воздушным холодильником. Пробир­ку помещают на кипящую водяную баню и кипятят при слабом нагревании 1 ч. Затем пробирки охлаждают, фильтруют содержимое и с гидролизатом проводят реакции на составные части нуклеотидов.

 

А) Биуретовая реакция на белок.

К 5-6 каплям гидролизата прибавляют 10 капель 10 % раствора NaOH и 1 каплю 1 % раствора медного купороса. При наличии белка жидкость окрашивается в фиолетовый цвет.

 

Б) Серебряная проба на пуриновые основания.

К 0.5 мл гидролизата добавляют аммиак до щелоч­ной реакции по лакмусу и 0.5 мл аммиачного раствора серебра. Через 5 мин при стоянии выпадает не­большой хлопьевидный осадок серебряных соединений пу­риновых оснований.

 

В) Реакция на пентозы.

К 0.5 мл гидролизата добавляют 0.5 мл ра­створа NaOH и по каплям раствор сульфата меди до обра­зования гидрата окиси меди (избегать избытка). Нагревают до кипения. В случае присутствия моносахаридов (пентоз) образуется красный осадок закиси меди.

Г) Молибденовая проба на фосфорную кислоту.

К 0.5 мл гидролизата прибавляют равный объем мо­либденового реактива и кипятят несколько минут. Жид­кость окрашивается в лимонно-желтый цвет. При охлаж­дении образуется желтый осадок фосфорно-молибденовокислого аммония.

Сделать схему полного распада РНК-протеинов.

 

 

Тема 6

ФОТОСИНТЕЗ

 

(2ч)

 

Работа 17 Обнаружение крахмала

В зеленых листьях растений

 

Крахмал может быть обнаружен только в зеленых листьях растений.

 

Материал для исследования: зеленый и пожелтев­ший листья.

Оборудование: штатив с пробирками, спиртовка, водяная баня, мерный цилиндр (на 10 мл), фильтровальная бумага, пипетки.

Реактивы:1) этанол; 2) 1 % раствор йода.

 

Ход работы

В две пронумерованные пробирки помещают: в первую – зеле­ный лист растения, во вторую – желтый. В обе пробирки наливают по 1-2 мл дистиллированной воды и содержимое кипятят 2-3 мин. Горячую воду сливают и в пробирки наливают по 1 мл этилового спирта. Пробирки кипятят на водяной бане 3-5 мин при ежеминут­ном встряхивании. Пигменты жел­того и зеленого листа переходят в спирт, и листья обесцвечиваются. Окрашенный спирт сливают, а листья в пробирках заливают новыми порциями спирта и нагревают еще раз в течение 3-5 мин. Спирт сливают, а ли­стья промывают несколько раз дистиллированной водой. Затем в каждую пробирку наливают 3-4 мл дистиллированной воды и ки­пятят их на водяной бане для размягчения тканей листа. Через 5-10 мин воду сливают, листья помещают на фильтровальную бума­гу и наносят на них несколько капель раствора йода. При наличии крахмала наблюдают по­явление синих точек, а затем посинение всего листа.

 

 

Работа 18 Обнаружение каротина в шиповнике

 

Материал для исследования: плоды шиповника (сухие и свежие).

Оборудование: ступка с пестиком, весы, разновесы, штатив с пробирками, пипетки.

Реактивы: 1) хлороформ; 2) H₂SO₄ (конц.).

 

Ход работы

Сухие плоды шиповника за 2-3 ч перед работой следует замочить в воде при комнатной температуре. Далее работают с мякотью плодов. Мякоть плодов (50 мг) растирают в ступке, переносят в чи­стую сухую пробирку, добавляют 5-10 капель хлороформа и встря­хивают несколько раз. Каротин переходит в хлороформный раствор. Три капли полученной вытяжки переносят в чистую сухую пробир­ку, по стенке приливают еще 5 капель концентрированной серной кислоты и осторожно встряхивают. Реакцию проводить в вытяжном шкафу! В присутствии каротина верхний хлороформный слой жидкости окрашивается вначале в зеленоватый, а затем в синий цвет.

 

 

Тема 7

УГЛЕВОДЫ. ЛИПИДЫ

 

(2 ч)

 

Работа 19 Обнаружение редуцирующих веществ

В вытяжке из моркови

 

При нагревании водной вытяжки из моркови с реактивом Феллинга появляется желтый осадок гидрата закиси меди или красный осадок закиси меди, что обусловлено наличием глюкозы и других ре­дуцирующих веществ, способных восстанавливать гидрат окиси ме­ди в закись.

 

Материал для исследования: корнеплоды морковь.

Оборудование: штатив с пробирками, спиртовка, мерный цилиндр (на 10 мл), фильтровальная бумага, воронка, весы и разновесы, пипетки, терка.

Реактивы: реактив Феллинга.

 

Ход работы

 

Морковь натирают на терке, около 0,5 г полученной массы по­мещают в пробирку, добавляют 2 мл воды и кипятят 3-4 мин. Жид­кость отфильтровывают. С фильтратом (10-20 капель) проделывают реакцию Феллинга.

 

 

Работа 20 Обнаружение перекисных соединений

В растительном масле

 

При взбалтывании хлороформного раствора растительного мас­ла в кислой среде с раствором йодистого калия жидкость приобрета­ет желтую окраску вследствие образования молекулярного йода из йодистого калия, окисляемого перекисными соединениями, которые могут содержаться растительном. При­сутствие йода подтверждается окрашиванием крахмала в синий цвет.

 

Материал для исследования: подсолнечное масло (свежее и после термической обработки).

Оборудование: штатив с пробирками, пипетки.

Реактивы: 1) смесь ледяной уксусной кислоты с хлороформом, 2:1; 2) 2 % раствор йоди­стый калий; 3) 0,5 % раствор крахмала; 4) 0,1 н. раствор гипосульфита натрия (Na₂S₂O₃).

 

Ход работы

В одну пробирку вносят 2 капли свежего подсолнечного масла, в другую – 2 капли масла после жарки. Добавляют в каждую пробирку по 10 капель смеси ледяной уксусной кислоты с хлороформом, по 5 ка­пель раствора йодистого калия и встряхивают. Затем еще по 2 капли 0,5 % раствора крахмала. Одна пробирка остается бесцветной (свежее масло), в другой – жидкость окрашивается в синий цвет (несвежее масло). В пробирку, окрашенную в синий цвет, добавляют по каплям раствор гипосульфита и наблюдают исчезновение синей окраски. Чем больше капель гипосульфита пошло на обесцвечивание, тем вы­ше содержание перекисных соединений.

 

 

Работа 21 Обнаружение желчных кислот

 

Материал для исследования: раствор желчи (курицы или рыбы).

Оборудование: часовое стекло, пипетки, стеклянная палочка.

Реактивы: 1) 20 % раствор сахарозы; 2) H₂SO₄ (конц.).

 

Ход работы

Приготовить раствор желчи: 1 мл желчи + 2 мл воды. На сухое часовое стекло наносят одну каплю желчи и 1 каплю раствора сахарозы, хорошо перемешивают стеклянной палочкой. Рядом наносят 3 капли концентрированной серной кислоты (стекло не двигать с места). Через некоторое время на месте слияния капель наблюдают развитие красного окрашивания, переходящего при стоянии в красно-фиолетовое. Это реакция Петтенкофера.

 

Тема 8

ХИМИЯ МОЛОКА

(2 ч)

 

 

Работа 22 Химия молока

Молоко представляет собой эмульсию жира в молоч­ной плазме. В состав молока входят:

1) вода;

2) липиды – триглицериды, содержащие главным образом олеи­новую и пальмитиновую кислоты, фосфолипиды – фосфатидилхолины и фосфатидилэтаноламины, а также хо­лестерин;

3) белки – казеиноген, молочный альбумин и молочный глобулин;

4) углеводы – лактоза (молочный сахар) и в небольшом количестве глюкоза;

5) ферменты – амилаза, липаза, каталаза, дегидрогеназа и др.;

6) ви­тамины – А, С, группы В и др.;

7) минеральные ве­щества: калий, натрий, кальций, магний, фосфор, хлор, железо (следы).

Таким образом, молоко является ценнейшим пище­вым продуктом, так как в его состав входят важнейшие питательные вещества.

Большое практическое значение имеет вопрос о срав­нительной ценности женского и коровьего молока. Срав­нивая их состав, можно видеть, что в отношении белков, углеводов и солей имеется резкая разница.

 

Таблица 11

 

Ингредиенты	Женское молоко	Коровье молоко
Общий белок	1,2-1,5 %	3,3 %
Казеиноген	0,8-1,0 %	2,7 %
Альбумины и глобулины	0,4-0,6 %	0,6 %
Лактоза	6,0-7,0 %	4,8 %
Липиды	3,5 %	3,7 %
Соли	0,3 %	0,7 %

 

 

Из приведенной таблицы видно, что при замене жен­ского молока коровьим необходимо разбавить коровье молоко в 2-3 раза водой и одновременно добавить неко­торое количество сахара.

Материал для исследования: различные сорта молока.

Оборудование: штатив с пробирками, спиртовка, водяная баня, мерный цилиндр (на 10 мл), фильтровальная бумага, пипетки, лактометр, мерный цилиндр, воронка, колбы на 50 мл, пинцет, химический стакан.

Реактивы: 1) этанол; 2) 1 % раствор йода; 3) лакмус; 4) фенолфталеин; 5) 3 % раствор уксусной кислоты; 6) 1 % раствор едкого натрия; 7) 10 %-го раствора NaOH; 8) 2 % раствор CuSO₄; 9) насыщенный раствор (NH₄)₂SO₄; 10) порошок (NH₄)₂SO₄; 11) 3,75 % раствора молибденовокислого аммония в азотной кислоте; 12) 0,2 % раствора щавелевокислого аммония; 13) раствор пепсина; 14) 10 % раствор CaCl₂; 15) 5 % раствор CuSO₄; 16) 5 % раствор (CH₃COO)₂Pb.

 

Ход работы

Опыт 1. Определение плотности молока

Удельный вес молока колеблется от 1,028 до 1,036 г/см³. Снятое молоко вследствие удаления жиров имеет более высокий удельный вес, разбавленное молоко – более низкий удельный вес вследствие уменьшения количества плотных веществ. В цилиндр наливают молоко, погружают в него лак­тометр, следя за тем, чтобы он не касался стенок цилинд­ра, и производят отсчет. Определяют удельный вес как цельного, так и разведенного молока.

 

Опыт 2. Определение реакции среды молока по лакмусу и фенолфталеину

Реакция среды молока обусловлена одновременным присутствием кислореагирующих однозамещенных и щелочнореагирующих двухзамещенных фосфорнокислых со­лей щелочных металлов.

Молоко травоядных и всеядных животных имеет обычно нейтральную реакцию по лакмусу, рН молока равен 6.5-7.0. В пробирку наливают 1 мл молока и смачивают им лакмусовую бумажку, после чего в пробирку прибавляют 1-2 капли фенолфталеина. Отмечают реакцию среды мо­лока по лакмусу и фенолфталеину.

 

Опыт 3. Качественные реакции на составные части молока

Осаждение казеиногена. Белок молока – казеино­ген – относится к сложным белкам – фосфопротеидам, его простетическая группа содержит большое количество ортофосфорной кислоты, соединенной с аминокислотами серином и треонином. Казеиноген не свертывается при нагревании, растворим в растворах разбавленных щелочей. В молоке казеиноген находится в виде растворимой в воде кальциевой соли. В изоэлектрической точке (при
рН = 4.7) казеиноген переходит в изоэлектрическое состояние, те­ряет свою устойчивость и выпадает в осадок.

В колбочку наливают 2,5 мл молока и 5 мл дистил­лированной воды. Содержимое колбочки хорошо переме­шивают и добавляют по каплям 0,5 мл раствора уксусной кислоты. Затем снова хорошо перемешивают и оставляют стоять на 5-10 мин. Осадок белка отфильтро­вывают, фильтрат разливают в четыре пробирки и исполь­зуют в последующих работах.

Осадок белка после промывания водой растворяют на фильтре 1 мл 1 % раствора гидроксида натрия. С полу­ченной жидкостью проделывают биуретовую реакцию: прибавляют равный объем 10 % раствора гидроксида на­трия и 1-2 капли раствора сульфата меди, перемешивают. Жидкость окрашивается в фиолетовый цвет.

 

Опыт 4. Осаждение молочного альбумина и гло­булина

Молочный альбумин и глобулин обладают всеми свой­ствами белков соответствующих групп (альбуминов и гло­булинов): они свертываются при кипячении и высалива­ются в насыщенном (альбумины) и полунасыщенном (гло­булины) растворе сернокислого аммония. В первую пробирку с фильтратом добавляют равный объем насыщенного раствора сернокислого аммония, вы­падает осадок. Раствор фильтруют и фильтрат насыщают порошком сернокислого аммония. Вторично выпадает оса­док.

 

Опыт 5. Реакция на молочный сахар

Молочный сахар — лактоза, состоит из остатков β-галактозы и α-глюкозы, соединенных между собой 1,4-глюкозидной связью, вследствие чего обладает восста­новительной способностью.

С фильтратом во второй пробирке проделывают ре­акцию Троммера: в пробирку наливают 0.5 мл исследуе­мой жидкости, добавляют 5-6 капель раствора гидроксида натрия и по каплям раствор сульфата меди до образования легкой неисчезающей мути. Пробирку осторожно нагревают, сначала появляется желтое окрашивание, а затем образуется желтый или крас­но-коричневый осадок.

 

Опыт 6. Реакция на соли фосфорной кислоты

К фильтрату в третьей пробирке прибавляют 5-6 ка­пель 3.75 % раствора молибденовокислого аммония в азотной кислоте и нагревают до кипения. Медленно обра­зуется желтый кристаллический осадок фосфорно-молибденовокислого аммония.

 

Опыт 7. Реакция на соли кальция

К фильтрату в четвертой пробирке прибавляют 2-4 капли раствора щавелевокислого аммония. Вы­падает осадок не растворимого в воде щавелевокислого кальция.

 

Опыт 8. Створаживание молока

Под влиянием фермента пепсина происходит створа­живание молока, так как пепсин обладает способностью превращать казеиноген в казеин, кальциевые соли кото­рого нерастворимы в воде.

Приготовить раствор молока: 1 мл молока + 19 мл воды.

 

Таблица 12

 

Реагенты, условия опытов	Количество реагента, мл
Проба 1	Проба 2	Проба 3	Проба 4
Раствор молока
Раствор пепсина, капель	5-6	-	-	-
Раствор прокипяченного пепсина, капель	-	5-6	-	-
Раствор щавелевокислого аммония, капель	-	-	5-6	5-6
Слегка встряхнуть пробирки

Продолжение

Раствор пепсина, капель	-	-	5-6	5-6
Термостат, 37 – 42 ºC, 10 - 15 мин
Отметить створаживание молока
Раствор CaCl2	-	-	-	5-6
Вывод:

 

Опыт 9. Осаждение белков молока солями тя­желых металлов

В три пробирки наливают по 1 мл молока и прибав­ляют в первую – 2-3 капли раствора сульфата меди, во вторую – 2-3 капли раствора уксус­нокислого свинца.

Наблюдают осаждение белков молока.

 

Приложение