Тонкослойной ионообменной хроматографии

Разделение аминокислот из их смеси производят на катионообменной синтетической смоле, на которую нанесен сильный катионит в натриевой форме. При нанесении образца на пластинку все аминокислоты должны сорбироваться в стартовой позиции путем их обмена с катионом натрия. Следова­тельно, все аминокислоты в исходной пробе должны быть в форме катионов, что достигается доведением наносимого раствора до рН < 2.2. Степень удержания аминокислот смолой зависит от степе­ни диссоциации основных и кислотных групп аминокислот, от числа этих групп в молекуле, от способности к гидрофобным взаимодействиям со смолой и некоторых других ус­ловий. Ароматические и основные аминокислоты (арг, гис, лиз, фен, тир), а также лейцин прочно удерживаются на катионите. Для их разделения применяют пропускание нитратного буфера рН 5.25 с концентрацией Na⁺ 0.35 моль через слой смолы. В этих условиях все остальные аминокислоты (кислые и нейтральные) приобретают высокую подвижность и идут с фронтом растворителя. Для выявле­ния отдельных аминокислот пластинку опрыскивают раствором нингидрина. Появляются фиолетовые пятна аминокислот, распола­гающиеся по всей длине пластинки по степени возрастания подвиж­ности аминокислот. Полуколичественная оценка содержания ами­нокислоты в смеси достигается путем сравнения величины пятна из анализируемого образца с пятном соответствующей стандартной аминокислоты.

Исследуемый материал: растворы аминокислот.

Оборудование: хроматографическая камера, пластинки для ТСХ.

Реактивы: 1) стандартная смесь аминокислот, 0.01 н. НС1; 2) цитратный буфер рН 5.28, 3) нингидриновый реактив.

Ход работы

 

На пластинке мягким карандашом отмечают линию старта на расстоянии 1.5-2.0 см от нижнего края. На этой линии через равные промежутки отмечают 7 точек для нанесения растворов аминокис­лот. С помощью капилляров наносят по 1.5 мкл (3 касания) рабочих растворов каждой из шести аминокислот и смеси аминокислот (од­но касание — 0.5 мкл, что соответствует 2*10^-3 мкмоль каждой ами­нокислоты). Между касаниями пятно подсушивают. Нельзя царапать слой катионита капилляром! Таким образом, впервые шесть точек внесены последовательно арг, гис, лиз, фен, тир, лей, а в седьмую — смесь аминокислот.

В камеру для хроматографии наливают цитратный буфер с рН 5.28 на высоту 1 см и помешают пластинку с нанесенными образцами. Стартовая позиция смеси аминокислот должна быть выше уровня налитого буферного раствора. Для разделения аминокислот буфер должен подняться по пластинке ровным фронтом на высоту 15 см. Для этого требуется около 2 ч. Процесс разделения можно значи­тельно ускорить, предварительно пропитав пластинки разбавленным (в 10 раз) буфером и высушив их.

По окончании разделения пластинки вынимают из сосуда с бу­фером, нижние кромки следует промокнуть фильтровальной бумагой и пластинки высушить в вытяжном шкафу при комнатной температуре. Затем их устанавливают в наклон­ном положении в вытяжном шкафу и опрыскивают из пульверизатора нингидрином до равномерного пропитывания. Потом их снова высушивают и прогревают в термостате при 40-50 °С 20 мин. Выявляются фиолетовые пятна аминокислот (снизу вверх): арг, гис, лиз, фен, тир, лей. Необходимо сравнить положение пятен стандартных растворов аминокислот с положением их при хроматографировании смеси аминокислот. Хроматограмму зарисовать в тетради.

 

 

Работа 5 Очистка белков методом диализа

Диализ – освобождение коллоидов от низкомолекулярных ор­ганических и минеральных примесей с помощью диффузии послед­них через мембраны. Белки в растворе благодаря значительной вели­чине молекул не диффундируют сквозь полупроницаемую мембрану.

Исследуемый материал:раствор яичного белка.

Оборудование:пипетки, мерный цилиндр – 50 мл, цилиндрические маленькие пробирки 4 шт., стеклянные палочки, штатив для пробирок, химический стакан, нитки, целлофан, спиртовки, пробиркодержатель, кристаллизатор.

Реактивы:1) 10 % раствор NaOH; 2) 1 % раствор CuSO₄; 3) Феллингова жидкость; 4) 1 % раствор яичного белка с примесью 1 % раствора глюкозы;
5) дистиллированная вода.

 

Ход работы

Наливают 15-20 мл исследуемого раствора в целлофановый ме­шочек и погружают его в стакан с дистиллированной водой таким образом, чтобы открытый край мешочка выступал над поверхностью воды. Через 1 ч с водой из стакана и раствором белка, содержащим примесь углеводов, проделывают биуретовую реакцию (на белок) и реакцию Феллинга (на глюкозу), чтобы убедиться в отсутствии белка и наличии глюкозы в воде из стакана.

Биуретовая реакция. К 5 каплям исследуемого раствора приба­вить 3 капли 10 % раствора гидроксида натрия и 1 каплю 1 %раствора сульфата меди (II), перемешать. Содержимое пробирки приобретает си­не-фиолетовый цвет, что указывает на присутствие белка в растворе.

Реакция Феллинга. К 5 каплям исследуемого раствора прибавить 5 капель феллинговой жидкости и нагреть. Наблюдается образование оксида меди (I) красного цвета (Cu₂O), что указывает на присутствие глюкозы в растворе.

Работа 6 Методы количественного определения белка на примере биуретовой реакции

 

Для количественного определения белков применяют физи­ческие, химические и биологические методы.

Наибольшее распространение из физических методов количе­ственного определения белков получили три: рефрактометриче­ский (по показателю преломления белковых растворов), спектрофотометрический (по поглощению в ультрафиолетовой обла­сти спектра) и полярографический (по кривым, показывающим зависимость между силой тока и напряжением, приложенным к системе, содержащей белок). Пикнометрический метод (по плот­ности белковых растворов) употребляется редко.

Химические методы количественного определения белков разнообразны. Наиболее простым химическим методом опреде­ления белка является количественное определение общего или белкового (после осаждения белка и отделения его от раство­римых азотсодержащих веществ) азота. Умножая величину процентного содержания общего азота на коэффициент 6.25 (среднее содержание азота в белках – 16 %, отсюда 100:16 = 6.25), получают данные о содержании сырого протеина. Про­делывая ту же операцию с величиной, характеризующей содер­жание белкового азота, получают данные о количестве белка. Эти способы условны, так как дают приблизительную оценку о количестве белка.

Биологические методы количественного определения белков применимы лишь к белкам, обладающим ферментативной и гормональной активностью. Измеряя степень биологической ак­тивности препарата, можно составить представление о содержа­нии в нем белка, обладающего данной активностью. Этот метод тоже не дает абсолютных результатов.

Самым распространенным химическим методом количествен­ного определения белков является колориметрический метод. Он основан на измерении интенсивности окраски цветных реакций, раз­вивающихся при взаимодействии белков с тем или иным специ­фическим реагентом. Чтобы рассчитать концент­рацию белка, в этом случае строят калибровочный график.

Биуретовый метод основан на способности растворов белка давать фиолетовое окрашивание при взаимодейст­вии с раствором сульфата меди в щелочной среде. Интен­сивность окраски пропорциональна концентрации белка в растворе.

Материал для исследования: растворы яичного белка концентрации 5, 10 и 15 мг/мл, и раствор белка неизвестной концентра­ции.

Оборудование: штативы с пробирками; бюретки для биуретового реактива; склянки с растворами белка; пи­петки на 1 мл; ФЭК с кюветами с толщиной слоя 1 см, миллиметровка.

Реактивы: биуретовый реактив.

 

Ход работы

1. В первые 3 пробирки помещают стандартные растворы с содержанием белка 5, 10 и 15 мг в 1 мл. Эти пробирки служат для построения ка­либровочной кривой. В четвертую пробирку наливают раствор с неизвестной концентрацией белка, которую нужно опре­делить.

2. В каждую пробирку добавляют по 4 мл биуретового реактива. Содержимое пробирок хорошо перемешивают и оставляют при комнатной температуре на 20 мин для раз­вития окраски. Окрашенные растворы колориметрируют на ФЭКе в кюветах с толщиной слоя 1 см, пользуясь зе­леным светофильтром (длина волны 540 нм). В качестве контрольного раствора при измерении на ФЭКе исполь­зуют биуретовый реактив.

3. Строят калибровочный график, откладывая на оси абсцисс концентрации стандартных растворов белка, а на оси ординат - соответствующие – значения оптической плотности. Зная оптическую плотность раствора белка с неизвестной концентрацией, по калибровочной кривой определяют в нем содержание белка.

Записывают принцип метода; зарисовывают калибро­вочный график зависимости оптической плотности от концентрации стандартного раствора белка. Пользуясь этим графиком, рассчитывают содержание белка в испы­туемом растворе и записывают результат.

 

Тема 3

ФЕРМЕНТЫ

(4 ч)

Работа 7 Ферменты как биологические катализаторы

 

Ферменты, энзимы – специфические белки всех живых клеток, играющие роль биологических катализаторов. С их помощью осуществляется обмен веществ и энергии в организмах.

Свойства ферментов:

1. Все ферменты белковой природы (простые и слож­ные).

2. Все ферменты характеризуются термолабильностью, т.е. оптимум дей­ствия 0- 45 °С.

3. Ферменты специфичны; различают абсолютную и от­носительную специфичность.

4. Ферменты действуют в мягких условиях среды, с определенным значением рН.

5. Ферменты обладают высокой каталитической актив­ностью (например, холинэстераза за 1 с расщепля­ет 300 000 молекул ацетилхолина).

 

Исследуемый материал: раствор слюны.

Оборудование: пипетки, мерный цилиндр – 50 мл, цилиндрические маленькие пробирки 15 шт., стеклянные палочки, штатив для пробирок, химический стакан, пробиркодержатель, спиртовка, спички.

Реактивы: 1) 1 % раствор крахмала; 2) 10 % раствор NaOH; 3) 1 % раствор CuSO₄; 4) фосфатный буфер; 5) 1 % раствор NaCl; 6) водный раствор I₂ в КI.

 

Ход работы

Для исследования активности амилазы слюны и ее свойств используют собственную слюну, разведенную в 10 раз. Для этого в мерную пробирку собирают 1 мл слюны (предварительно полость рта ополаскивают водой) и доводят до метки 10 мл.

 

Опыт 1 .Определение термолабильности амилазы слюны.

Таблица 4

Реагенты, условия опытов	Количество реагента, капель
Опыт А	Опыт Б	Контроль
Раствор слюны		-	-
Кипяченая слюна (кипятить 2 мл раствора слюны 5-8 мин, охладить)	-		-
Вода	-	-
Крахмал
Термостат, 38 ºC, 10 мин
Реакция с иодом (5 капель раствора из пробирки + 1капля I2 в КI), окраска
Реакция Троммера (5 капель раствора из пробирки + 5 капель 10 % NaOH + 3 капли 1 % CuSO4, кипятить 1 мин), окраска
Вывод:

 

Таблица 5

Опыт 2. Влияние температуры на скорость ферментативной реакции.

Реагенты, условия опытов	Проба 1	Проба 2	Проба 3	Проба 4
Крахмал, мл
Раствор слюны, мл
Температура, ºC
Инкубировать 10 мин и затем добавить по 1-2 капли I2 в КI
Зарегистрировать окрашивание

Таблица 6

 

Опыт 3. Определение оптимума рН для действия амилазы.

 

Реагенты	Условия опытов
Значение рН
6.0	6.4	6.8	7.2	7.6	8.0
Буферный раствор, мл
Крахмал, 0,5 %, мл
Раствор слюны, мл
Термостат, 38 ºC, 10 мин
Раствор I2 в КI, капель
Окраска
Вывод:

 

Таблица 7

Опыт 4. Влияние активаторов и ингибиторов на активность амилазы.

 

Реагенты, условия опытов	Количество реагента
Проба 1	Проба 2	Контроль
Раствор слюны, мл
Вода, капель	-	-
NaCl, капель		-	-
CuSO4 , капель	-		-
Крахмал, капель
Экспозиция, 5 мин
Раствор I2 в КI, капель
Результат, окраска
Вывод:

 

Работа 8 Свойства ферментов

Исследуемый материал: раствор слюны, срезы клубней вареного и сырого картофеля.

Оборудование: пипетки, мерный цилиндр – 50 мл, цилиндрические маленькие пробирки 10 шт, стеклянные палочки, штатив для пробирок, химический стакан, пробиркодержатель, спиртовка, спички.

Реактивы: 1) 1 % раствор крахмала; 2) Феллингова жидкость, 3) 1 % раствор сахарозы; 4) гваяковая настойка; 5) NaI (порошок); 6) NaCl (порошок); 7) КClO₃ (порошок); 8) фильтрат дрожжей.

 

 

Ход работы

 

 

Опыт 1 .Специфичность действия ферментов

Для действия ферментов характерна специфичность:

а) абсо­лютная – фермент катализирует превращение строго определенного вещества (уреаза расщепляет только мочевину на СО₂ и NH₃);

б) относительная – фермент катализирует превращения одного типа свя­зей в ряду близких по химическому строению веществ (например, липаза катализирует разрыв сложноэфирных связей независимо от типа радикала);

в) групповая относительная – то же, но для разрыва связи важны образующие ее атомные группировки. Все протеолитические ферменты расщепляют пептидные связи, но пепсин, трипсин и химотрипсин расщепляют пептидные связи, образованные только определенными аминокислотами;

г) стереохимическая – фермент катализирует превращение только одного стереоизомера при наличии рацемата (L-оксидазы превращают L-аминокислоты, но не D-аминокислоты).

 

Приготовить раствор слюны: 1мл слюны + 4 мл воды.

Таблица 8

Реагенты, условия опытов	Количество реагента, капель
Проба 1	Проба 2	Проба 3	Проба 4
Раствор слюны			-	-
Фильтрат дрожжей	-	-
Крахмал		-		-
Сахароза	-		-
Термостат, 37 ºC, 10 мин
Реакция Феллинга (по 5 капель раствора из каждой пробирки + 3 капли реактива Феллинга, кипятить 1 мин), окраска
Вывод:

 

Опыт 2. Исследование свойств фермента тирозиназы из картофеля

Тирозиназа – фермент, окисляющий аминокислоту тирозин в темный пигмент за счет кислорода. Этот фермент может окислить и гвоякову смолу. В результате образуется озонид синего цвета.

Таблица 9

Реагенты, условия опытов	Срез сырого картофеля	Срез вареного картофеля
Гваяковая настойка, капель
Результат
Вывод

Опыт 3. Ингибирующее действие хлорид-ионов на дегидрогеназный комплекс картофеля.

Хлорид-ионы ингибируют дегидрогеназный комплекс, и в их присутствии поверхность среза картофеля остается без изменений; в остальных случаях она темнеет.

 

Таблица 10

 

Срезы клубней картофеля	Нанесение порошка	Результат, окраска (15-20 мин)	Вывод
	-
	NaCl
	NaI
	КClО3

 

Тема 4

ВИТАМИНЫ

 

(8 ч)

 

Работа 9 Качественные реакции на витамины

Витамины – это низкомолекулярные органические соединения различной химической природы, необходимые для осуществления жизненно важных биохимических и физиологических процессов в живых организмах. При этом витамины не используются для пластических и энергетических нужд организма. Человек в сутки потребляет око­ло 600 г пищи (в пересчете на сухое вещество), из этого количества на долю витаминов приходится 100-200 мг. В настоящее время существует несколько номенклатур витаминов:

1) по предложению Э. Мак-Коллума (1913), их обозначают латинскими буквами А, В, С, D, Е, К и др.;

2) наименование по физиологическому действию — к названию болезни, которую предупреждает или излечивает витамин, до­бавляется приставка aнmu- (антискорбутный, антигеморрагический, антистерильный и др.);

3) химическое наименование.

В 1974 г. принята временная классификация витаминов.

Витамины, растворимые в воде:В₁ – тиамин, антиневротичес­кий; В₂ – рибофлавин, витамин роста; В₃ – пантотеновая кислота, антидерматитный; В₅ (РР) – никотиновая кислота, антипеллагрический; В₆ – пиридоксол, антидерматитный; В₁₂ – цианкобаламин, антианемический; В_с – фолиевая кислота, антианемический; Н – биотин, антисеборейный; С – аскорбиновая кислота, антискорбут­ный; Р – рутин, капилляроукрепляющий.

Витамины, растворимые в жирах:А – ретинол, антиксерофтальмический; D – кальциферол, антирахитический; Е – токоферол, антистерильный; К – филлохинон, антигеморрагический.

Витаминоподобные вещества:холин, липоевая кислота, оротовая кислота, витамин В₁₅, инозит, ПАБК (парааминобензойная кисло­та), карнитин, витамин U.

Биологическое действие большинства витаминов сводится к уча­стию их в ферментативных реакциях в качестве кофакторов фермен­тов (коферментная функция). Для витаминов, растворимых в воде, известны антивитамины. Это аналоги витаминов, которые оказывают противоположное витаминам действие (например, антивитами­ном тиамина является окситиамин). Среди жирорастворимых вита­минов антивитамины известны только к витамину К – производные кумарина (дикумарин, варфарин, тромексан).

Недостаточное поступление витаминов с пищей вызывает забо­левания, называемые гиповитаминозами. При отсутствии одного из витаминов в пище развивается авитаминоз, при недостатке несколь­ких – полигиповитаминозы, а при их отсутствии в пище – полиави­таминозы. При чрезмерном введении витаминов (как правило, жи­рорастворимых) могут развиваться гипервитаминозы.

 

Исследуемый материал:фармакопейные препараты витаминов А, С, Е, D, Р, В₁, В₆, В₁₂, викасола.

Оборудование: пипетки, мерный цилиндр – 10 мл, цилиндрические маленькие пробирки 10 шт., стеклянные палочки, штатив для пробирок, пробиркодержатель, спиртовка, спички, воронка, фильтровальная бумага, химический стакан, флюороскоп.

Реактивы:

1) H₂SO₄ (конц.), 23 % раствор хлороформа, 5 % раствор FeCl₃;

2) анилиновый реактив (15 частей анилина и 1 часть HCl (конц.)), 23 % раствор хлороформа;

3) раствор цистеина – 0.25 г/л, раствор NaOH – 100 г/л, раствор викасола – 0.5 г/л;

4) HNO₃ (конц.), сахароза (порошок), 1 %раствор FeCl₃;

5) 10 % раствор NaOH, 10 % раствор HCl, 5 % раствор K₄[Fe(CN)₆]; 1 %раствор FeCl₃, 0.01 % раствор метиленового синего, 10 % раствор Na₂CO₃, раствор Люголя (0.1 % раствор иода в рас­творе йодистого калия);

6) 1 % раствор FeCl₃, рутин, насыщенный раствор, H₂SO₄ (конц.), 0.5 % раствор HCl, феллингова жидкость, 10 % раствор NaOH;

7) диазореактив – 5 капель 1 % раствора сульфаниловой кислоты + 5 капель 5 % раствор NaNO₂, 10 % раствор Na₂CO₃;

8) HCl (конц.), Zn (мет.);

9) 1 %раствор FeCl₃;

10) H₂SO₄ (конц.), 30 % раствор NaOH, 10 % раствор тиомочевины.

 

Ход работы

Провести качественные реакции на витамины А, С, Е, D, Р, В₁, В₆, В₁₂.

 

Опыт 1. Качественные реакции на витамин А

Реакция на витамин А с концентрированной серной кислотой. В су­хую пробирку вносят 1 каплю раствора витамина А и 5 капель раствора хлороформа, перемешивают и добавляют 1 каплю концентрирован­ной серной кислоты. Реакцию проводить в вытяжном шкафу! Отмечают результат реакции.

Реакция на витамин А с хлорным железом. В сухую пробирку вно­сят 1 каплю витамина А и 5 капель раствора хлороформа. Перемешива­ют, добавляют 3 капли хлорида железа. Реакцию проводить в вытяжном шкафу! Отмечают результат реакции.

 

Опыт 2. Качественные реакции на витамин D

В сухую пробирку вносят 2 капли витамина D, 10 капель раствора хлорофор­ма и 1-2капли анилинового реактива, осторожно нагревают при постоянном помешивании. Реакцию проводить в вытяжном шкафу! Отмечают результат реакции.

 

 

Опыт 3. Качественная реакция на викасол

К 5 каплям раствора викасола добавляют равное количество рас­твора цистеина и 1 каплю раствора едкого натра. Отмечают результат реакции.

 

Опыт 4. Качественные реакции на витамин Е

Реакция с азотной кислотой. В сухую пробирку вносят 6 капель ви­тамина Е, добавляют несколько крупинок сахарозы. Осторожно по стенке пробирки прибавляют 10 капель концентрированной азотной кислоты. Реакцию проводить в вытяжном шкафу! Отмечают результат реакции.

Реакция с хлорным железом. В сухую пробирку вносят 0,5 мл ви­тамина Е, затем 0,5 мл раствора хлорного железа (III) и тщательно перемешивают содержимое пробирки. Отмечают результат реакции.

 

 

Опыт 5. Качественные реакции на витамин С

Реакция с железосинеродистым калием K₄[Fe(CN)₆]. В две пробирки вносят по 1 капле раствора NaOH и по 1 капле раствора железосинеродистого калия. В одну пробирку добавляют 5 капель раствора вита­мина С, в другую — столько же воды. Перемешивают, добавляют по 3 капли раствора соляной кислоты и по 1 капле раствора хлор­ного железа. В пробирке с витамином С образуется осадок берлинской лазури, в контрольной пробирке наблюдается бурое окрашивание, обусловленное образованием железосине-родистой соли окиси железа.

Реакция с метиленовым синим. В две пробирки вносят по 1 кап­ле раствора метиленового синего, по 1 капле раствора соды. В одну из них добавляют несколько капель раствора аскорбино­вой кислоты, в другую – 1 мл воды. В пробирке с аскорбиновой кислотой происходит обесцвечивание метиленового синего (при нагревании).

Реакция с раствором Люголя. В две пробирки вносят по 10 капель дистиллированной воды и по 2 капли раствора Люголя. В одну про­бирку прибавляют – 10 капель дистиллированной воды, в другую -10 капель раствора аскорбиновой кислоты. В пробирке с аскорбино­вой кислотой раствор Люголя обесцвечивается в результате восста­новления йода до йодистоводородной кислоты.

 

Опыт 6. Качественные реакции на витамин Р

Реакция с хлоридом железа. Хлорид железа образует с рутином комплексное соединение, окрашенное в изумрудно-зеленый цвет. К 12 мл насыщенного водного раствора рутина прибавляют не­сколько капельраствора хлорида железа. Отмечают результат реакции.

Реакция с концентрированной серной кислотой. Концентрирован­ная серная кислота образует с флавонами и флавоноидами оксониевые соли, растворы которых имеют ярко-желтую окраску. На границе двух жидкостей возникает окрашенное в желтый цвет кольцо. К 1-2 мл насыщенного водного раствора рутина осторожно по стен­ке пробирки добавляют 1 мл концентрированной серной кислоты. Реакцию проводить в вытяжном шкафу! Отмечают результат реакции.

Реакция с феллинговой жидкостью. При кислотном гидролизе рутина отщепляется молекула рутинозы, которая далее распадает­ся на глюкозу и рамнозу, обладающими восстанавливающими свой­ствами. К 0,5 г рутина добавляют 5 мл раствора соляной кислоты. Смесь доводят до кипения, кипятят в течение 1 мин, затем отфильт­ровывают. К полученному фильтрату приливают 3 мл раствора едкого натра и 3 мл феллинговой жидкости, нагревают до кипения. Отмечают результат реакции.

 

Опыт 7. Качественная реакция на витамин В₁

Диазореакция. В щелочной среде витамин В₁ с диазореактивом обра­зует сложное комплексное соединение оранжевого цвета, которое образуется на границе двух жидкостей в виде кольца.К диазореактиву добавляют еще 1-2 капли раствора витамина В₁. Затем по стенке, наклонив пробирку, осторожно добавляют 5-7 капель раствора Na₂CO₃. Отмечают результат реакции.

Опыт 8. Качественная реакция на витамин В₂

Реакция восстановления витамина В₂. Окисленная форма витамина В₂ представляет собой желтое флюоресцирующее в ультрафиолетовых лучах вещество. Реакция на витамин В₂ основана на его способности легко восстанавливаться; при этом раствор витамина В₂, имеющий желтую окраску, приобре­тает сначала розовый цвет (за счет образования промежуточных со­единений), а затем обесцвечивается (восстановленная форма витамина В₂ бесцветна).В пробирку наливают 10 капель раствора витамина В₂, добавля­ют 5 капель концентрированной соляной кислоты и опускают зер­нышко металлического цинка. Реакцию проводить в вытяжном шкафу! Начинается выделение пузырьков во­дорода, жидкость постепенно розовеет, затем обесцвечивается. Сравнивают обе формы витамина В₂ по флюоресценции, поместив пробирку у флюороскопа.

 

Опыт 9. Качественные реакции на витамин В₆

Реакция с хлоридом железа. Витамин В₆ при взаимодействии с раствором хлорида железа (III) образует комплексную соль типа фено­лята железа красного цвета. К 5 каплямраствора витамина В₆ приливают равное количе­ство раствора хлорного железа и перемешивают. Отмечают результат реакции.

Флюоресценция витамина В₆.. В пробирку вносят 10 капель рас­твора витамина. Поместив пробирку у флюороскопа, наблюдают го­лубую флюоресценцию.

Опыт 10. Качественная реакция на витамин В₁₂

При взаимодействии ионов кобальта с тиомочевиной при нагре­вании образуется роданид кобальта (II) зеленого цвета.Содержимое одной ампулы витамина В₁₂ переливают в пробир­ку, добавляют 3 капли концентрированной серной кислоты и произ­водят сжигание до обесцвечивания в вытяжном шкафу! По оконча­нии минерализации осторожно добавляют в пробирку сначала 10 ка­пель воды, затем 10 капель раствора NaOH. Воду и щелочь добав­ляют осторожно при помешивании. На беззольный фильтр наносят 2-3 капли раствора тиомочевины и высушивают над плиткой. После этого наносят на фильтр 1-2 капли полученного минерализата и сно­ва нагревают над плиткой. На фильтре, чаще по краю пятна, появля­ется зеленое окрашивание, свидетельствующее о наличии кобальта.

 

Работа 10 Выделение и обнаружение фолиевой

Кислоты из дрожжей

Материалы для исследования: прессованные дрожжи.

Оборудование: ступка с пестиком, песок, центрифуга, штатив с пробирками, химический стаканчик, стеклянная палочка, лакмусовая бумага, флюороскоп, фильтр, воронка для фильтрования.

Реактивы: 1) 0.1 н и 0.005 н растворы NaOH; 2) ледяная уксусная кислота; 3) 0.4 % KMnO₄; 4) 3 % раствор Н₂О₂.

 

Ход работы

 

В ступку помещают 10 г дрожжей, добавляют 10 мл 0.1 н раствора гидроксида натрия, 2 г песка и растирают 5 мин. Затем центрифугируют 15 мин при 3000 об./мин. Соблюдать все правила работы с центрифугой! Фильтруют. К 10 каплям над осадочной жидкости приливают 20 капель ледяной уксусной кислоты и 10 капель раствора перманганата калия так, чтобы розовое окрашивание не исчезало в течении 10 мин. Реакцию проводить в вытяжном шкафу! Через 10 мин удаляют избыток перманганата калия добавлением 4-5 капель раствора перекиси водорода и приливают 0.005 н раствор гидроксида натрия (приблизительно 5 мл) до рН 4.0 – 4.5. При ультрафиолетовом облучении фолиевой кислоты в щелочном растворе в флюороскопе наблюдается голубая флюоресценция.

 

 

Работа 11 Разделение смеси водорастворимых