Будова, функції і властивості ДНК.

Хімічний склад ДНК і її макромолекулярна організація. Типи спіралей ДНК. Молекулярні механізми рекомбінації, реплікації і репарації ДНК. Поняття про нуклеазах і полимеразах. Реплікація ДНК як умова передачі генетичній інформації нащадкам. Загальна характеристика процесу реплікації. Дії, що відбуваються у вилці реплікації. Реплікація теломеров, теломераза. Значення недорепликации кінцевих фрагментів хромосом в механізмі старіння. Системи виправлення помилок реплікації. Коректорські властивості ДНК-полимераз. Механізми репарації пошкодженої ДНК. Поняття про захворювання репарації ДНК. Молекулярні механізми загальної генетичної рекомбінації. Сайт-специфічеськая рекомбінація. Генна конверсія.

 

У 1865г. Грегор Мендель відкрив гени, а його сучасник Фрідріх Мішер в 1869г. відкрив нуклеїнові кислоти (у ядрах кліток гноїть і сперматозоїдів лосося). Проте довго ще ці відкриття не зв'язували один з одним, довго ще структуру і природу речовини спадковості не знали. Генетична роль НК була встановлена після відкриття і пояснення явищ трансформації (1928, Ф.Гріффітс; 1944, О. Евері), трансдукции (1951, Ледерберг, Циндер) і розмноження бактеріофагів (1951, А. Херши, М. Чейз).

Трансформація, трансдукция і розмноження бактеріофагів переконливо довели генетичну роль ДНК. У РНК - вірусів (СНІДУ, гепатиту В, грипу, ВТМ, лейкозу мишей і ін.), що містять, цю роль виконує РНК.

Будова нуклеїнових кислот. НК — біополімери, що беруть участь в зберіганні і передачі генетичній інформації. Мономери НК — нуклеотиды, що складаються з азотистої підстави, моносахариду і однієї або декількох фосфатних груп. У складі НК всі нуклеотиды є монофосфатами. Нуклеотід без фосфатної групи називається нуклеозидом. Цукор, що входить до складу НК, є D-изомер і в-аномер рибозы або 2-дезоксирибозы. Нуклеотіди, що містять рибозу, називаються рибонуклеотидами і є мономерами РНК, а нуклеотиды — похідні дезоксирибозы, є дезоксирибонуклеотидами, і з них складається ДНК. Азотисті підстави бувають двох типів: пурини — аденин, гуанин і пиримидины — цитозин, тимин, урацил. До складу РНК і ДНК входять аденин, гуанин, цитозин; урацил зустрічається тільки в РНК, а тимин тільки в ДНК.

У ряді випадків в НК присутні ті, що рідко зустрічаються мінорні нуклеотиды, такі як дигидроуридин, 4-тиоуридин, інозин і ін. Різноманітність їх особливо велике у тРНК. Мінорні нуклеотиды утворюються в результаті хімічних перетворень підстав НК, що відбуваються вже після утворення полімерного ланцюга. Надзвичайно поширені в РНК і ДНК різні метилированные похідні: 5-метилуридин, 5-метилцитидин, l-N-метиладенозин, 2-И-метилгуанозин. У РНК об'єктом метилирования можуть бути і 2'-гидроксигруппы залишків рибозы, що приводить до утворення 2'-О-метилцитидина або 2'-О-метилгуанозина.

Рібонуклеотідниє і дезоксирибонуклеотидные ланки з'єднуються між собою за допомогою фосфодиэфирных містків, що зв'язують 5'-гидроксильную групу одного нуклеотида з 3'-гидроксильной групою наступного. Таким чином, регулярний основний ланцюг утворений фосфатними і рибозными залишками, а підстави приєднані до сахарам подібно до того, як приєднані бічні групи в білках. Порядок проходження підстав уздовж ланцюга називається первинною структурою НК. Послідовність підстав прийнято читати в напрямі від 5'- до 3'- вуглецевому атому пентозы.

Структура ДНК. Модель структури ДНК у вигляді подвійної спіралі була запропонована Уотсоном і Криком в 1953 г (рис.7).

Згідно цієї тривимірної моделі, молекула ДНК складається з двох протилежно направлених полинуклеотидных ланцюгів, які щодо однієї і тієї ж осі утворюють праву спіраль. Азотисті підстави знаходяться усередині подвійної спіралі, і їх площини перпендикулярні основній осі, а сахарофосфатные залишки експоновані назовні. Між підставами утворюються специфічні Н-связи: аденин — тимин (або урацил), гуанин — цитозин, що отримали назву уотсон-криковского спаровування. В результаті об'ємніші пурини завжди взаємодіють з пиримидинами, що мають менші розміри, що забезпечує оптимальну геометрію остову. Антипаралельні ланцюги подвійної спіралі не є ідентичними ні по послідовності підстав, ні по нуклеотидному складу, але вони комплементарны один одному саме завдяки наявності специфічного водневого скріплення між вказаними вище підставами.

Комплементарність дуже важлива для копіювання (реплікації) ДНК. Співвідношення між числом різних підстав в ДНК, виявлену

 

 

Ріс.7. У - форма ДНК

 

 

Чарграффом з соавт. у 50-х рр., мали велике значення для встановлення структури ДНК: було показано, що число адениновых залишків в підставах ланцюга ДНК, незалежно від організму, рівне числу тиминовых, а число гуаниновых — числу цитозиновых. Ця рівність є наслідком виборчого спаровування підстав (рис.8).

Геометрія подвійної спіралі така, що сусідні пари підстав знаходяться один від одного на відстані 0.34 нм і повернені на 36° навколо осі спіралі. Отже, на один виток спіралі доводиться 10 пар підстав, і крок спіралі рівний 3.4 нм. Діаметр подвійної спіралі рівний 20 нм і в ній утворюються два жолобки — великий і малий. Це пов'язано з тим, що сахарофосфатный остов розташований далі від осі спіралі, чим азотисті підстави.

Стабільність структури ДНК обумовлена різними типами взаємодії, серед яких основними є Н-связи між підставами і міжплощинна взаємодія (стэкинг). Завдяки останньому забезпечуються не тільки вигідні ван-дер-ваальсовы контакти між атомами, але і виникає

 

Ріс.8. Принцип комплементарності і антипаралельності ланцюгів ДНК

 

додаткова стабілізація унаслідок перекриття р-орбиталей атомів паралельно розташованих підстав. Стабілізації сприяє також сприятливий гидрофобный ефект, що виявляється в захищеності малополярних підстав від безпосереднього контакту з водним середовищем. Навпаки, сахарофосфатный остов з його полярними і іонізованими групами експонований, що також стабілізує структуру.

Для ДНК відомо чотири поліморфні форми: А, В, З і Z. Звичайною структурою є В-ДНК, в якій площині пар підстав перпендикулярні осі подвійної спіралі (рис.7.). У А-ДНК площини пар підстав повернені приблизно на 20° від нормалі до осі правої подвійної спіралі; на виток спіралі тут доводиться 11 пар підстав. У С-ДНК на витку спіралі 9 пар підстав. Z-ДНК — це ліва спіраль з 12 парами підстав на виток; площини підстав приблизно перпендикулярні осі спіралі. ДНК в клітці зазвичай знаходиться у В-форме, але окремі її ділянки можуть знаходитися в A, Z або навіть в іншій конформації.

Подвійна спіраль ДНК не застигла освіта, вона знаходиться в постійному русі:

· деформуються зв'язки в ланцюгах;

· розкриваються і закриваються комплементарні пари підстав;

· ДНК взаємодіє з білками;

· якщо напруга в молекулі велика, то вона локально розплітається;

· права спіраль переходить в ліву.

Розрізняють 3 фракції ДНК:

1.Частоповторяемая (сателіт) – до 106 копій генів (у миші 10%). Вона не бере участь в синтезі білка; розділяє гени; забезпечує кросинговер; містить транспозоны.

2.Слабоповторяемая – до 102 - 103 копій генів (у миші 15%). Містить гени синтезу т-РНК, гени синтезу білків рибосом і білків хроматина.

3.Унікальна (неповторювана) – у миші 75% (у людини 56%). Складається із структурних генів.

Локалізація ДНК: 95 % ДНК локалізується в ядрі в хромосомах (лінійна ДНК) і 5 % - в мітохондріях, пластидах і клітинному центрі у вигляді кільцевої ДНК.

Функції ДНК: зберігання і передача інформації; репарація; реплікація.

Два ланцюги ДНК в області гена принципово розрізняються по своїй функціональній ролі: одна з них є такою, що кодує, або смисловий, друга — матричною.

Це означає, що в процесі «прочитування» гена (транскрипції або синтезу пре-мРНК) як матриця виступає матричний ланцюг ДНК. Продукт же цього процесса-пре-мРНК — по послідовності нуклеотидов співпадає з кодуючим ланцюгом ДНК (із заміною тиминовых підстав на урациловые).

Таким чином, виходить, що за допомогою матричного ланцюга ДНК при транскрипції відтворюється в структурі РНК генетична інформація кодуючого ланцюга ДНК.

Головними матричними процесами, властивими всім живим організмам, є реплікація ДНК, транскрипція і трансляція.

Реплікація — процес, при якому інформація, закодована в послідовності підстав молекули батьківської ДНК, передається з максимальною точністю дочірньої ДНК. При напівконсервативній реплікації дочірні клітки першого покоління отримують один ланцюг ДНК від батьків, а другий ланцюг є знов синтезованим. Процес здійснюється за участю ДНК-полимераз, яка відноситься до класу трансфераз. Роль матриці грають розділені ланцюги двунитевой материнської ДНК, а субстратами є дезоксирибонуклеозид-5'-трифосфаты.

Транскрипція — процес перенесення генетичної інформації від ДНК до РНК. Всі види РНК - мРНК, рРНК і тРНК - синтезуються відповідно до послідовності підстав в ДНК, матрицею, що служить. Транськрібіруєтся тільки одна, так звана «+»-цепь ДНК. Процес протікає за участю РНК-полімераз. Субстратами є рибонуклеозид-5'-трифосфаты.

Процеси реплікації і транскрипції у прокариот і эукариот істотно розрізняються за швидкістю протікання і по окремих механізмах.

Трансляція — процес декодування мРНК, в результаті якого інформація з мови послідовності підстав мРНК перекладається мовою амінокислотної послідовності білка. Здійснюється трансляція на рибосомах, субстратами є аминоацил-тРНК.

Матричний синтез ДНК, що каталізує ДНК-полимеразами, виконує дві основні функції: реплікацію ДНК — синтез нових дочірніх ланцюгів і репарацію двунитевых ДНК, що має розриви в одному з ланцюгів, що утворилися в результаті вирізування нуклеазами пошкоджених ділянок цього ланцюга. У прокариот і эукариот існує три різновиди ДНК-полимераз. У прокариот виділені полимеразы I, II і III типів, що позначаються як pol l, pol ll і pol III. Остання каталізує синтез ланцюга, що росте, pol грає важливу роль в процесі дозрівання ДНК, функції pol ll вивчені не повністю. У эукариотических клітках в реплікації хромосом бере участь ДНК-полимераза Ь, в репарації — ДНК-полимераза в, а г різновид є ферментом, що здійснює реплікацію ДНК мітохондрій. Ці Ферменти, незалежно від типу кліток, в яких відбувається реплікація, приєднують нуклеотид до ОН-ГРУППЕ на З'-конце одного з ланцюгів ДНК, яка росте у напрямі 5'>3. Тому говорять, що дані Ф володіють 5'>3'-полимеразной активністю. Крім цього всі вони проявляють здатність деградувати ДНК, відщеплюючи, нуклеотиды у напрямі 3'>5, тобто є 3'>5'-экзонуклеазами.

У 1957 р. Мезельсон і Сталь, вивчаючи E. coli встановили, що на кожному вільному ланцюзі фермент ДНК-полимераза будує новий, комплементарний ланцюг. Це напівконсервативний спосіб реплікації: один ланцюг старий – інша нова!

Зазвичай реплікація починається в строго певних ділянках, що отримали назву ділянок ori (від origin of replication), і від цих ділянок розповсюджується в обидві сторони. Ділянкам ori передують точки розгалуження материнських ланцюгів ДНК. Ділянка, що примикає до точки розгалуження, отримала назву репликативной вилки (рис.9). В ході синтезу репликативная вилка переміщається уздовж молекули, при цьому розплітаються все нові ділянки батьківської ДНК до тих пір, поки вилка не дійде до точки терминации. Розділення ланцюгів досягається за допомогою спеціальних Ф — геликаз (топоизомераз). Енергія, необхідна для цього, вивільняється за рахунок гідролізу АТФ. Гелікази переміщаються уподовж полинуклеотидных ланцюгів в двох напрямах.

Для початку синтезу ДНК необхідна приманка — праймер. Роль праймера виконує коротка РНК (10—60 нуклеотидов). Вона синтезується комплементарно певній ділянці ДНК за участю праймазы. Після утворення праймера в роботу включається ДНК-полимераза. На відміну від геликаз ДНК-полимеразы можуть переміщатися тільки від 3' до 5' кінця матриці. Тому элонгация ланцюга, що росте, у міру розкручування двунитевой материнської ДНК може йти тільки уздовж одного ланцюга матриці, тій, щодо якої вилка реплікації рухається від 3' до 5' кінця. Ланцюг, що безперервно синтезується, отримав назву тієї, що лідирує. Синтез на ланцюзі, що запізнюється, також починається з утворення праймера і йде в напрямі, протилежному провідному ланцюгу, — від вилки реплікації. Ланцюг, що запізнюється, синтезується фрагментарно (у вигляді фрагментів Оказаки), оскільки праймер утворюється тільки тоді, коли вилка реплікації звільнить ту ділянку матриці, яка має спорідненість до праймазе. Лігированіє (зшивання) фрагментів Оказаки з утворенням єдиного ланцюга носить назву процесу дозрівання.

При дозріванні ланцюга РНК-затравка віддаляється як з 5' кінця провідного ланцюга, так і з 5' кінців фрагментів Оказаки, а ці фрагменти зшиваються один з одним. Видалення приманки здійснюється за участю 3'>5' экзонуклеазы. Цей же Ф замість видаленої РНК приєднує дезоксинуклеотиды, використовуючи свою 5'>3' полимеразную активність. При цьому у разі приєднання «неправильного» нуклеотида здійснюється «коректорська правка» — видалення підстав, створюючих некомплементарні пари. Цей процес забезпечує надзвичайно високу точність реплікації, що відповідає одній помилці на 109 пар підстав.

 

Ріс.9. Реплікація ДНК:

1 — репликативная вилка, 2 — ДНК-полимераза (pol I — дозрівання);

3 — ДНК-полимераза (pol III — «коректорська правка»); 4—геликаза;

5—гираза (топоизомераза); 6—белки, дестабилизирующие двойную спираль.

 

 

Корекція здійснюється в тих випадках, коли до З'-концу ланцюга, що росте, приєднується «неправильний» нуклеотид, нездібний утворити потрібні водневі зв'язки з матрицею. Коли pol III помилково приєднує неправильну підставу, «включається» її 3' -» 5'-экзонуклеазная активність, і ця підстава негайно віддаляється, після чого відновлюється полимеразная активність. Такий простий механізм діє завдяки тому, що pol III здатна працювати як полимераза лише на досконалій подвійній спіралі ДНК з абсолютно правильним спаровуванням підстав.

Ще один механізм видалення РНК-фрагментов заснований на присутності в клітках персоною рибонуклеазы, що отримала назву Рнкази Н. Етот Ф специфічний до двунитевым структур, побудованих з однієї рибонуклеотидной і одного дезоксирибонуклеотидной ланцюга, причому він гідролізує першу з них.

Рнказа Н також здатна видаляти Рнк-праймер з подальшою забудовою розриву за допомогою ДНК-полимеразы. На завершальних етапах збірки фрагментів в потрібному порядку діє ДНК-ЛІГАЗА, що каталізує утворення фосфодиэфирной зв'язку.

Розкручування геликазами частини подвійної спіралі ДНК в хромосомах эукариот приводить до тієї, що надспіралізує решти частини структури, що неминуче позначається на швидкості процесу реплікації. Ті, що надспіралізують перешкоджають ДНК-ТОПОЇЗОМЕРАЗИ.

Таким чином, в реплікації ДНК, крім ДНК-полимеразы, бере участь великий набір Ф: геликаза, праймаза, Рнказа Н, ДНК-ЛІГАЗА і топоизомераза. Цим перелік Ф і білків, що беруть участь в матричному біосинтезі ДНК, далеко не вичерпується. Проте багато з учасників цього процесу до теперішнього часу залишаються мало вивченими.

В процесі реплікації відбувається «коректорська правка» - видалення неправильних (створюючих некомплементарні пари) підстав, включених в знов синтезовану ДНК. Цей процес забезпечує надзвичайно високу точність реплікації, що відповідає одній помилці на 109 пар підстав.

Теломери. У 1938г. класики генетики Б.Мак-клінтон и Г. Меллер довели, що на кінцях хромосом є спеціальні структури, які назвали теломерами (телос-конец, мерос-часть).

Учені виявили, що при дії рентгенівським опромінюванням стійкість проявляють лише теломеры. Навпаки, позбавлені кінцевих ділянок, хромосоми починають зливатися, що веде до важких генетичних аномалій. Т.ч., теломеры забезпечують індивідуальність хромосом. Теломери щільно упаковані (гетерохроматин) і малодоступні для ферментів (теломеразы, метилазы, эндонуклеаз і ін.)

Функції теломер.

1.Механические: а) з'єднання кінців сестринських хроматид після S-фазы; би) фіксація хромосом до ядерної мембрани, що забезпечує кон'югацію гомологов.

2.Стабилизационные: а) оберігання від недорепликации генетично значущих відділів ДНК (теломеры не транскрибируются); б) стабілізація кінців розірваних хромосом. У хворих би - таласемією в генах би - глобіну відбуваються розриви хромосоми 16д і до пошкодженого кінця додаються теломерные повтори (ТТАГГГ).

3.Вплив на експресію генів. Активність генів, розташованих поряд з теломерами, понижена. Це прояв сайленсинга – мовчання транскрипції.

4.«Счетная функція». Теломери виступають як годинний пристрій, який відлічує кількість ділень клітки. Кожне ділення укорочує теломеры на 50-65 н.п. А всього їх довжина в клітках ембріона людини складає 10-15 тисяч н.п.

Теломерная ДНК потрапила у поле зору біологів зовсім недавно. Перші об'єкти дослідження – одноклітинні прості – війкова інфузорія (тетрахимена), яка містить декілька десятків тисяч дуже дрібних хромосом і, значить, безліч теломер в одній клітці (у вищих эукариот менше 100 теломер на клітку).

У теломерной ДНК інфузорії багато разів повторюються блоки з 6-ти нуклеотидных залишків. Один ланцюг ДНК містить блок 2 тимин – 4 гуанин (ТТГГГГ - Г-ланцюг), а комплементарний ланцюг - 2 аденин – 4 цитозин (ААЦЦЦЦ - Ц-цепь).

Як же було здивування учених, коли виявили, що теломерная ДНК людини відрізняється від такої у інфузорії всього лише однією буквою і утворює блоки 2 тимин – аденин – 3 гуанин (ТТАГГГ). Більш того, виявилось, що з ТТАГГГ - блоків побудовані теломеры (Г – ланцюг) всіх ссавців, рептилій, амфібій, птахів і риб.

Втім, дивуватися тут нічому, оскільки в теломерной ДНК не закодовано ніяких білків (вона не містить гени). У всіх організмів теломеры виконують універсальні функції, мова про яких йшла вище. Дуже важлива характеристика теломерных ДНК – їх довжина. У людини вона коливається від 2 до 20 тисяч пар підстав, а у деяких видів мишей може досягати сотень тисяч н.п. Відомо, що біля теломер є спеціальні білки, що забезпечують їх роботу і що беруть участь в побудові теломер.

Доведено, що для нормального функціонування кожна лінійна ДНК повинна мати два теломеры: по одній теломере на кожен кінець.

У прокариот теломеров немає – їх ДНК замкнута в кільце.