Клонування організмів і кліток.

 

Клітинна інженерія. Поняття про клонування. Природні і штучні клони. Історія клонування організмів. Біологічні і етичні проблеми клонування. Терапевтичне клонування і його перспективи в медицині.

 

Клітинна інженерія. Поняття про клонування. Термін «клон» походить від грецького слова «klon», що означає гілочка, втеча, нащадок і має відношення, перш за все до вегетативного розмноження. Строго кажучи, навіть вегетативне розмноження мікроорганізмів діленням можна назвати клонуванням.

Клонуванню можна давати багато визначень. Ось деякі найпоширеніші з них: клонування - популяція кліток або організмів подій від загального предка шляхом безстатевого розмноження, причому нащадок при цьому генетично ідентичний своєму предкові. Відтворення організмів що повністю повторюють особину, можливо тільки в тому випадку, якщо генетична інформація матери буде без яких-небудь змін передана дочкам. Але при природному статевому розмноженні цьому перешкоджає мейоз. В ході мейоза незріла яйцеклітина, що має подвійний, або диплоидный набір хромосом - носіїв спадкової інформації - ділитися двічі і в результаті утворюються чотири гаплоидных, з одинарним набором хромосом, клітки. Три з них дегенерируют, а четверта з великим запасом живильних речовин, стає яйцеклітиною. У багатьох тварин вона в силу гаплоидности не може розвиватися в новий організм. Для цього необхідне запліднення. Організм, що розвинувся із заплідненої яйцеклітини, набуває ознак, які визначаються взаємодією материнської і батьківської спадковості. Отже, при статевому розмноженні мати не може бути повторена в потомстві.

Як же всупереч цій строгій закономірності змусити клітку розвиватися тільки з материнським диплоидным набором хромосом? Теоретично вирішення цієї важкої біологічної проблеми знайдене.

Природні і штучні клони. У природі все-таки є випадки клонування людини, це однояйцовые або монозиготные близнята - справжні клони з одним і тим же геномом, що виникають при розділенні однієї зиготы на ранній стадії розвитку. Це завжди тільки обидва хлопчики або обидві дівчатка і завжди дивно схожі один на одного. Відомо також, що ембріон ссавця, у тому числі і людини на найраніших стадіях розвитку, у людини, принаймні, до стадії 8 бластомеров, може бути без видимих негативних наслідків роздільний на окремі бластомеры. З них за певних умов можуть розвинутися ідентичні по своєму генотипу особини, по аналогії з однояйцовыми близнятами, тобто з одного 8-клітинного ембріона можуть народитися 8 хлопчиків або дівчаток абсолютно ідентичних.

У природі широко поширено клонування рослин. Перш за все, це відноситься до вегетативного розмноження, що давно використовується людиною. Річ у тому, що у рослин на відміну від тварин у міру їх зростання, в ході клітинної спеціалізації - диференціювання - клітки не втрачають так звані тотипотентные властивості, тобто, не втрачають своєї здатності реалізовувати всю генетичну інформацію, закладену в ядрі. Тому практично будь-яка рослинна клітка, що зберегла в процесі диференціювання своє ядро, може дати початок новому організму. Ця особливість рослинних кліток лежить в основі багатьох методів генетики і селекції.

При вегетативному розмноженні і при клонуванні гени не розподіляються по потоках, як у разі статевого розмноження, а зберігаються у повному складі протягом багатьох поколінь. Всі організми, що входять до складу певного клона мають однаковий набір генів і фенотипически не розрізняються між собою.

Клітки тварин, диференціюючись, позбавляються тотипотентности, і в цьому, одна з істотних відмінностей від кліток рослин. Як буде показано нижче саме тут головна перешкода для клонування дорослих хребетних тварин.

Історія клонування організмів. Клонування рослин живцями, нирками або бульбами в сільському господарстві, зокрема в садівництві, відомо вже більш 4-х тис. років. Починаючи з 70-х років нашого сторіччя, для клонування рослин почали широко використовувати невеликі групи, і навіть окремі соматичні клітки. Набагато більшу складність представляє клонування тварин. Перші кроки до клонування тварин були зроблені близько ста років тому зоологом Московського Університету Олександром Тіхоміровим, що відкрив на прикладі тутового шовкопряда партеногенез: розвиток без запліднення в результаті хімічних і фізичних дій. Проте партеногенетические ембріони шовкопряда були нежиттєздатні.

У 30-і роки минулого століття академіком Б. Астауровим проводилася серія досліджень, в результаті яких було підібрано термічну дію, здатну одночасно активувати незапліднене яйце до розвитку і блокувати процес перетворення ядра яйцеклітини з подвійним хромосомним набором в ядро з одинарним набором. Таким чином, були отримані перші генетичні копії. На жаль, і таке потомство відрізнялося низькою життєздатністю. Надалі цей метод був вдосконалений академіком Ст. Струнниковим, роботи якого по клонуванню шовкопряда здобули у результаті світову популярність.

Історія клонування хребетних починається в 40-і роки 20-го століття, коли російський ембріолог професор, Г. Лопашов на жабах розробив метод пересадки ядер, на якому засновані всі сучасні експерименти по клонуванню. Метод полягає у виділенні ядра соматичної клітки і імплантації його в обезъядренную (энуклеированную) яйцеклітину. Стаття, написана по матеріалах цих експериментів, була відправлена до «Журналу загальної біології» в серпні 1948 року. Проте світла вона так і не побачила унаслідок тієї, що відбулася місяцем пізніше за сесію ВАСХНІЛ, що привела до безмежного панування «лысенковщины» в біології. Через декілька років, на початку 50-х вже американські ембріологи Кинг і Бріггс провели досліди, подібні до експериментів Лопашова, і «переоткрыли» метод, чим і прославилися.

Вперше можливість клонування ембріонів хребетних була продемонстрована американськими біологами на жабах на початку 50-х років. Потім в 1962 році зоолог Оксфордського університету Дж. Гердон істотно просунув ці результати, коли в дослідах з південноафриканськими жабами почав використовувати як донора ядер не зародкові клітки, а вже клітки епітелію кишечника пуголовка, що підріс, що цілком спеціалізувалися. Виживали не більше двох відсотків клонованого потомства, та і у тих, що вижили спостерігалися різні дефекти. Проте це був величезний крок вперед по шляху клонування.

Перейти від амфібій до ссавцем виявилося вельми важко, головним чином з тієї причини, що розміри яйцеклітини у ссавців приблизно в тисячу разів менше, ніж у земноводних. Але до кінця 70-х ці труднощі вдалося подолати, так що на початок 80-х були освоєні експерименти по клонуванню ембріонів мишей, а до кінця десятиліття учені почали отримувати важливі результати на ембріонах кроликів і крупних домашніх тварин. Аж до середини 90-х років питання про використання дорослих ссавців як донори ядер кліток практично не ставилося, оскільки учені-біологи займалися головним чином клонуванням ембріонів домашніх тварин, причому експерименти в цій області і по цю пору проходять вельми непросто і з високим рівнем невдач. Тому справді сенсацією стала історія з клонуванням в 1996 році знаменитої нині овечки Доллі в шотландській фірмі PPL Therapeutics (комерційного відділення Розлін Інституту в Едінбургу). Колектив учених, очолюваний Іеном Уїлмутом, продемонстрував, що їм вдалося, використовуючи соматичні клітки дорослої тварини, отримати клональное тварину - вівцю по кличці Доллі. Проте цьому передувала велика робота.

Ще в 1986 році Уїландсин показав, що ембріони овець на 16-клітинній стадії розвитку зберігають тотипотентность. Реконструйовані яйцеклітини, що містять ядра бластомеров 16-клітинних зародків, розвивалися нормально до стадії бластулы в перев'язаному яйцепроводі вівці (у агаровому циліндрі), а після звільнення від агару, пересаджували в матку овцы- другого реципієнта - ще на 60 днів. У іншому випадку донорами служили ядра 8-клітинних зародків і було отримано трьох живих ягнят, фенотип яких відповідав породі овцы- донора.

У 1989 році Сміт і Уїлмут трансплантували ядра кліток 16-клітинного ембріона і ранньої бластулы в позбавлені ядра незаплідненої яйцеклітини овець. У першому випадку було отримано двох живих ягнят, фенотип яких відповідав породі овець - донорів ядер. У другому випадку один що повністю сформувався ягня загинув під час пологів. Його фенотип також відповідав породі-донорові. Автори вважали, що в ході диференціювання ембріональних кліток відбувається инактивация деяких важливих для розвитку генів і в результаті ядра бластулы вже не можуть репрограммироваться в цитоплазмі яйцеклітини і забезпечити нормальний розвиток реконструйованого зародка. Тому, на думку авторів, як донори ядер краще використовувати 16-клітинні ембріони або культивовані in vitro лінії ембріональних кліток, ядра яких володіють тотипотентностью.

Пізніше, в 1993-95 рр., група дослідників під керівництвом Уїлмута отримала клон овець - п'ять ідентичних тварин, донорами ядер яких була культура ембріональних кліток. Клітинну культуру отримували таким чином: виділяли мікрохірургічним шляхом ембріональний диск з 9-денного овечого ембріона (бластулы) і культивували клітки in vitro протягом багатьох пасажів (принаймні, до 25). Спочатку клітинна культура нагадувала культуру стволових диференційованих ембріональних клітин, але незабаром, після 2-3 пасажів, клітки ставали ущільненими і морфологічно схожими з епітеліальними. Ця лінія кліток з 9-денного зародка вівці була позначена як TNT4.

Щоб донорське ядро і реципиентная цитоплазма знаходилася на схожих стадіях клітинного циклу, зупиняли ділення культивованих клітин TNT4 на певній стадії (G0) і ядра цих кліток пересаджували в энуклеированные яйцеклітини (відповідно на стадії метафази II). Реконструйовані ембріони укладали в агар і трансплантували в перев'язані яйцепроводи овець. Через шість днів ембріони вимивали з яйцепроводів проміжних реципієнтів і досліджували під мікроскопом. Відбирали ті, які досягали стадії морулы і бластулы і пересаджували їх в матку вівці, - остаточного реципієнта, де розвиток тривав до народження. Народилося п'ять ягнят (самок), з них дві загинули незабаром після народження, третя у віці десяти днів, а дві що залишилися нормально розвивалися і досягли 8-9-місячного віку. Фенотіпічеськи всі ягнята були схожі з породою овець, від якої отримували початкову лінію кліток TNT4. Це підтвердив і генетичний аналіз.

Ця робота, особливо в частини культури ембріональних кліток, значне досягнення в клонуванні ссавців. Хоча вона і не викликала особливого інтересу, як стаття того ж Уїлмута із співавторами, опублікована в 1997 році, де повідомлялося, що в результаті використання донорського ядра клітки молочної залози вівці було отримано клональное тварина - вівця по кличці Доллі. Остання робота методично багато в чому повторювала попередні дослідження 1996 року, але в ній учені використовували не тільки ембріональні, але ще і фибробластоподобные клітки (фибробласты - клітини сполучної тканини) плоду і клітки молочної залози дорослої вівці. Клітки молочної залози отримували від 6-річної вівці породи Фінн Дорсет, що знаходиться на останньому триместрі вагітності. Всі три типи клітинних культур мали однакове число хромосом - 54, як завжди у овець. Ембріональні клітки використовували як донорів ядер на 7-9 пасажах культивування, фибробластоподобные клітки плоду на 4-6 пасажах і клітки молочної залози на 3-6 пасажах. Ділення клітин всіх трьох типів зупиняли на стадії G0 і ядер кліток пересаджували в энуклеированные ооциты (яйцеклітини) на стадії метафази II. Більшість реконструйованих ембріонів спочатку культивували в перев'язаному яйцепроводі вівці, але деякі ембріони культивували in vitro в хімічно певному середовищі. Коефіцієнт виходу морул і бластул при культивуванні in vitro в одній серії дослідів був навіть удвічі вищий, ніж при культивуванні в яйцепроводі (тому мабуть, немає строгої необхідності в проміжному реципієнтові і можна обійтися культивуванням in vitro).

Вихід морул і бластул в серії дослідів з культурою кліток молочної залози, був приблизно втричі менше, ніж в двох інших серіях, коли як донори ядер використовували фибробластов плоду або ембріональних кліток. Число живих ягнят порівняно з числом пересаджених в матку остаточного реципієнта морул або бластул було також в два рази нижче. У серії дослідів з клітками молочної залози і 277 реконструйованих яйцеклітин був отриманий тільки один живий ягня, що говорить про дуже низьку результативність такого роду експериментів (0,36%). Аналіз генетичних маркерів всіх семи експериментів живих ягнят, що народилися в трьох серіях, показав, що клітки молочної залози були донорами ядер для одного, фибробласты плоду - для двох і ембріональні клітки для чотирьох ягнят. Вівця Доллі розвинулася з реконструйованої яйцеклітини, донором ядра якої була культивована клітка молочної залози вівці породи Фінн Дорсет. Доллі фенотипически не відрізняється від овець цієї породи, але сильно відрізняється від вівці-реципієнта породи шотландська чорноморда. Аналіз генетичних маркерів підтвердив цей результат.

Відносний успіх (Доллі померла від передчасного старіння) авторів цієї роботи, перш за все, зв'язаний з використанням тривалих клітинних культур, оскільки після багатьох пасажів в культурі кліток могли бути відібрані малодиференційовані стволові клітини, які ймовірно і були використані як донори ядер. Велике значення мав також той факт, що автори, враховуючи результат своїх минулих робіт, синхронізували стадії клітинного циклу яйцеклітин реципієнта і яйцеклітин донора.

Своєю роботою Уїлмут з колегами продемонстрували, що ядра кліток молочної залози дорослої вівці можуть бути за певних умов репрограммированы цитоплазмою ооцита і дати розвиток новому організму. Отримані дані змусили по-новому подивитися на процес клітинного диференціювання. Цей процес, як виявилось, не носить необоротний характер. Абсолютно ясно, що чинники цитоплазми здатні ініціювати розвиток нового організму на основі генетичного матеріалу ядра дорослої повністю диференційованої клітки. Таким чином, біологічний годинник може бути повернені назад, і розвиток організму може початися з генетичного матеріалу дорослої диференційованої клітки, що повністю противоречит раніше загальноприйнятій біологічній догмі.

Якщо результати останньої роботи Уїлмута і співавторів остаточно підтвердяться і буде підвищений коефіцієнт виходу живих тварин при використанні як донори ядер кліток дорослих тварин, то це може мати революційне значення в біотехнології тварин і тваринництві. Клонування дозволить зберегти не тільки генотип цінних і видатних у виробничому відношенні тварин, але і безмежно розмножувати їх.

Клонування високопродуктивних домашніх тварин, зокрема, молочних корів, може провести буквально революцію в сільському господарстві, оскільки тільки цим методом можна створити не окремі екземпляри, а цілі стада елітних корів рекордистів. Це ж відноситься до розмноження видатних спортивних коней, цінних хутрових звірів, збереженню рідкісних і зникаючих тварин в природних популяціях і так далі

Безпрецедентний по своєму масштабу експеримент по масовому клонуванню великої рогатої худоби недавно почався в Китаї. Як повідомляє місцевий друк, в Синьцзян-уйгурськом автономному районі на північному заході країни очікується поява від 20 до 50 клонованих телят. Проект ведеться компанією «Цзіньню» і є найбільшим у своєму роді в світі. У нім також беруть участь Австралія, Канада, США і Великобританія і низка інших країн. Китайські учені вважають, що клонування стане важливим кроком в розвитку тваринництва і поліпшенні племінної роботи.

Впровадження в практику методів міжвидового перенесення ядер може відкрити небачені перспективи для порятунку видів тварин, що знаходяться на межі зникнення. Як показали роботи Т. Домінко і соавт. у 1999 р., энуклеированные ооциты великої рогатої худоби після електрозлиття з ядрами шкірних фибробластов биків (Bos taurus), овець (Ovis aries), свиней (Sus scrofa), мавп (Масаса fascicularis) і щурів (Rattus rattus) можуть підтримувати розвиток ембріонів до ранніх стадій (в деяких випадках до стадій бластоцисты). У інших дослідженнях було зафіксовано, що энуклеированные яйцеклітини великої рогатої худоби забезпечують реалізацію генетичного матеріалу донорських ядер з соматичних кліток людини навіть до більш просунутих ембріональних стадій. Це є свідоцтвом того, що навіть перенесення ядер в ооциты далеких в еволюційному відношенні видів забезпечує їх часткове репрограммирование. А чи може бути так, що трансплантація ядер в энуклеированные яйцеклітини близьких видів приведе до отримання повноцінного здорового потомства? В кінці 2000 - початку 2001 р. весь науковий світ стежив за спробою дослідників з американської фірми «ACT» клонувати вимираючий вид буйволів Bos gaurus (гяур), який поширений на території Індії і Південно-західної Азії. Соматичні клітки-донори ядер (шкірні фибробласты) були отримані в результаті біопсії post mortem від бика у віці 5 років і після двох пасажів в культурі тривалий час (8 років) зберігалися в криоконсервированном поляганні в рідкому азоті. Всього було отримано чотири вагітності. Щоб підтвердити генетичне походження плодів, два з них були вибірково вилучені. Цитогенетичний аналіз підтвердив наявність в клітках характерного для гяурів нормального каріотипу, проте з'ясувалося, що вся мітохондріальна ДНК походить від корів-донорів яйцеклітин (Bos taurus).

Як відомо, мітохондрії є «енергетичними станціями» кліток, саме в них відбувається синтез АТФ, з'єднання з гиперергическими зв'язками, при руйнуванні яких виділяється велика кількість енергії, використовуваної в процесах життєзабезпечення клітки. Активність мітохондрій регулюється як власним генетичним апаратом - генами, закодованими в мітохондріальній ДНК, так і генами, локалізованими в ядрі клітки. Загальна кількість мітохондріальної ДНК (мДНК) в соматичній клітці налічує 20 000-30 000 молекул на відміну від яйцеклітини ссавця, в якій міститься близько 100 000 молекул мДНК. Таке явище, коли в цитоплазмі клітки знаходиться більш за один тип мДНК, називається мітохондріальною гетероплазмией. Мітохондріальна ДНК успадковується по материнській лінії разом з цитоплазмою ооцита, тому отримувані в результаті клонування тварини не є стовідсотковими клонами, тому що несуть мітохондрії донора ядер і індивідуумів-донорів реципиентных энуклеированных яйцеклітин, і володіють, таким чином, мітохондріальною гетероплазмией. Взаємодія між ядерною ДНК і чужорідною мДНК вимагає подальшого вивчення. Мабуть, що мітохондріальна гетероплазмия може приводити до дисбалансу в енергетичному обміні клітки і служити причиною серйозних порушень. На жаль, в досвіді американських учених одна з вагітностей урвалася на 200-денному терміні, а в результаті іншої народилося теля, яке померло через 48 ч. Представниками фірми було заявлено, що це відбулося «унаслідок інфекційного клостридиозного ентерита, що не має відношення до клонування».

Робляться і інші спроби клонування з метою порятунку зникаючих видів. Так, 11 корів з ферми в штаті айова вже виношують клони немовлят бантенгов - зникаючий різновид диких азіатських биків. Китайські учені з Інституту зоологічних досліджень, що мають намір клонувати зникаючих вид гігантських панд. Їх індійські колеги збираються аналогічним чином відновити популяцію гепардів, остаточно винищених мисливцями в першій половині минулого століття, ще в часи правління Британської імперії. Донорами яйцеклітин для клонованих тварин стануть гепарди з сусіднього Ірану, що належать до того ж вигляду, що і звіри, що раніше мешкали на півострові Індостан, а сурогатними матерями, в яких розвиватимуться пересаджені яйцеклітини - самки індійського леопарда.

Клонування рослин значно простіше, ніж клонування тварин. Ми розглянемо тільки порівняно нову технологію вирощування рослин з ізольованих груп кліток і окремих соматичних кліток.

Для клонування достатньо рослинну клітку ізолювати з цілої рослини і помістити на живильне середовище, що містить сольові компоненти, вітаміни, гормони і джерело вуглеводів, вона починає ділитися і утворює культуру каллуса. Надалі каллусы можна розмножити і отримати необмежену кількість біомаси. Основна трудність, з якою відразу ж доводиться стикатися дослідникові, - це те, що клітки в штучних умовах починають бурхливо ділитися і рости, але при цьому часто не в змозі продукувати вторинні метаболиты, тобто біологічно активні речовини рослин.

Клонування рослин частіше застосовується в комплексі з іншими біотехнологічними методами, такими як злиття (гібридизація) кліток і трансгенез (міжвидове перенесення генів). Цілі рослини з реконструйованих кліток отримують потім методом клонування. Злиття кліток здійснюється декількома способами з використанням так званих фузогенных (тобто що зливають) агентів різного походження: фізичного (змінне електричне або магнітне поле), хімічного (катіони, полиэтиленгликоль і ін.), біологічного (віруси). Рослинні клітки перед злиттям перетворюють на протопласты (тобто клітки, позбавлені зовнішньої жорсткої клітинної стінки). Подальший відбір (скринінг) отриманих гібридних кліток дозволяє відібрати ті з них, які об'єднали геноми або фрагменти ДНК батьківських кліток. Клітинна інженерія дозволяє отримувати гібридні штами, клітки або навіть цілі рослини (рослини-регенерати), схрещуючи між собою филогенетически (тобто еволюційно) віддалені організми. У разі неповного злиття кліток (тобто клітка-реципієнт отримує окремі ділянки ядерного генетичного матеріалу або частини клетки- донора (органеллы)) виходять асиметричні гібриди. Це розширює можливості отримання нових сортів сільськогосподарських рослин, для створення яких раніше використовувалися методи класичної селекції.

Біологічні і етичні проблеми клонування. За останній час створені ряд міжвидових і міжродових гібридів тютюну, картоплі, томату, капусти, турнепсу, сої і ін. Використання досягнень клітинної інженерії, наприклад, дозволило розробити технології отримання безвирусных рослин (наприклад, картоплі) шляхом регенерації цілої рослини з однієї соматичної клітки.

Учені працюють над зміною генотипів злаків. Вони вводять в їх генотипи спеціальний ген бактерій, який сприятиме засвоєнню азоту з атмосферного повітря. Вирішення цієї проблеми дозволило б скоротити витрати засобів на виробництво азотних добрив.

Перенесення генів використовується і при виведенні нових сортів декоративних рослин. Так, в генотип петунії був перенесений ген, що порушує утворення пігменту в пелюстках. Таким шляхом була створена петунія з білими квітками. Завдяки методам клітинної інженерії терміни, необхідні для виведення нових сортів рослині, скорочуються з 10-12 років при використанні звичайних методів селекції до 3-4 років.

Трансгенні рослини поступово завойовують мир. Особливо інтенсивно процес йде в США, Західній Європі, Японії, Китаї. Тільки у Китаї за деякими даними зареєстровано близько 120 генетично модифікованих сортів сільськогосподарських культур. У США генетично модифікована соя витіснила традиційну. Завдяки досягненням в області трансгенеза і клонування ми зможемо вже в найближче десятиліття повною мірою скористатися рослиною як найбільш дешевою і екологічно безпечною фабрикою для виробництва більшості необхідних людині матеріалів, їжі, лікарських препаратів, хімічних сполук, сировини і так далі

Якщо говорити про перспективи медичного застосування генетично модифікованих рослин, то найбільш популярне зараз питання про синтез вітаміну А в «Золотому рисі» — продукті сумісних наукових розробок груп Інго Потрікуса з Федерального технологічного інституту (Швейцарія) і Пітера Бейера з Університету Фрайбурга (Німеччина). Отримані результати по експресії людського соматотропина (гормону зростання) в хлоропластах тютюну. Це дослідження заклало нову тенденцію в біотехнології рослин, а саме: синтез фармацевтичних і діагностичних препаратів і оральних вакцин рослинами. Експресія соматотропина тютюном — це робота Джеффрі Стауба і його колег в Monsanto Co., результати якої опубліковані в журналі Nature Biotechnology (т. 18, з. 333, 2000). Синтез рослинами антитіл і оральних вакцин вже був описаний раніше. Недоліком попередніх робіт був відносно низький рівень експресії шуканих продуктів. І ось вперше важливий з фармацевтичної точки зору білок в значних кількостях синтезований шляхом використання нової системи експресії в хлоропластах.

Біотехнологія рослин грає важливу роль і у вирішенні продовольчої проблеми. Вона дає новий могутній інструмент, доповнюючий вже існуючі способи підвищення продуктивності сільського господарства і, як наслідок, стимулювання економічного зростання в бідних країнах. Проте, тоді як медична продукція вже отримала загальне визнання, впровадження генетично модифікованих продуктів харчування в деяких розвинених країнах зустріло сильну опозицію, зв'язану, головним чином, з недоліком генетичних знань і, як наслідок, необгрунтованими страхами. Проте, певні побоювання відносно трансгенних рослин мають під собою грунт.

На думку фахівців, трансгенні організми, переважно стійкі до шкідників (в основному за рахунок токсинів, що відбуваються з Bacillus thuringiensis) здатні викликати зміни в популяції комах, проте куди більший вплив робить застосування інсектицидів. Стійкість до солей, води, засусі і інші характеристики робитимуть вплив, передбачити яке важко, тому приступати до цих розробок слід з особливою обережністю. Крім того, слід гарантувати, що будуть зроблені всі необхідні заходи обережності у всіх випадках, коли продовольчі або кормові культури модифікуються з метою отримання фармакологічно активних з'єднань, які можуть бути перенесені до інших рослин, або проникати в грунт і потім у воду. В цілому продукти селекції рослин значно менш агресивні, чим початкові або дикі рослини. Це пояснюється тим, що в них людина прагне закріпити вигідні для себе якості, а це часто серйозно обмежує їх здатність виживати за межами фермерського поля, де культивування і контроль за бур'янами значно полегшує їм життя.

Так, наприклад, багато зернових культур відбиралися за тією ознакою, що їх колоси не розсипаються в процесі дозрівання. Це істотно полегшує збирання врожаю, і в той же час перешкоджає природному розповсюдженню насіння. Ймовірно, це виявиться справедливим і відносно генетично модифікованих рослин, оскільки по своїй основі вони також є культивованими рослинами. Недавні експерименти у Великобританії показали, що сільськогосподарські генетично модифіковані рослини, що тестуються на виживання в природних умовах, не мають ніяких переваг перед їх дикими родичами.

Та все ж існують деякі побоювання, що чужорідні гени з ГМ- рослин можуть передаватися іншим диким рослинам, внаслідок чого виникнуть бур'яни, які буде складніше утримати під контролем. Ця небезпека повинна бути усвідомлена. Вважається недалекоглядним вводити ген толерантності до гербіцидів в рис там, де червоний рис виростає як бур'ян, і в сорго там, де бур'яном є гумай (алепское сорго). Схрещування з цими видами сильних бур'янів може зробити неефективним використання гербіцидів для боротьби з ними. Поки що в результаті застосування трансгенних рослин несприятливі ефекти не виявлені.

Інше застосування технології клонування - культивування рослина на живильних середовищах. Таким шляхом з невеликої частини (клітки) рослини можна отримати до 1 млн. рослин в рік. Цей метод використовують для швидкого розмноження рідкісних або знов створених цінних сортів сільськогосподарських рослин.

При культивуванні кліток рослин на живильних середовищах з однієї клітки, що багато разів ділиться, можна отримати клони, в клітках яких накопичується у декілька разів більше цінних речовин, чим у вирощуваній звичайним способом цілій рослині. Так отримують, наприклад, біомасу женьшеня для потреб парфюмерної і медичної промисловості. У 1992-93 рр. в Биолого-почвенном інституті ДВО РАН була отримана трансгенна культура жень-шеня з вбудованим геном ризогенных бактерій (rolC). Трансгенне коріння мають дуже цікаві властивості. У окремих пробах вміст гинзенозидов в них склав до 6%, що істотно перевищує вміст цих речовин в природному корінні женьшеня. Трансгенна культура кирказона маньчжурського (Aristolochia manshuriensis Кіт.) є джерелом цінного препарату кардиотропного дії, застережливої розвиток інфаркту міокарду і ефективного при інфарктній для поста реабілітації.

Одним з нових напрямів є розробка способів микроклонального розмноження рідкісних і зникаючих рослин. Отримані мікророслини в культурі in vitro женьшеня, кирказона, незабудочника, метаплексиса, гиностеммы, василистника, родиолы, кодонопсиса і інших рідкісних рослин флори. Створення такого своєрідного «банку» рослин допоможе зберегти зникаючі в природі види. У міру розробки методів відновлення природних екосистем ці банки будуть використані для реинтродукции типових рослин в природні місцепроживання.

Окремим напрямом клітинної інженерії, що має величезне практичне значення, є отримання гибридом, тобто кліток, що виникають при злитті батьківських кліток з одного організму, але з різними програмами диференціації і розвитку. Це можуть бути клітки з різних типів тканини або пухлинні клітки. Найбільший розвиток гибридомная технологія знайшла в отриманні моноклональних антитіл (МКАТ). Методика була розроблена Келлером і Мільштейном.

В цьому випадку гибридому отримують між нормальною антителобразующей кліткою і пухлинною, плазмоцитомной кліткою. Плазмоцитома була узята тому, що вона більше всього відповідала АОК за типом диференціювання. Весь її синтетичний апарат був налаштований на синтез імуноглобулінів. Проблема полягала в тому, як відокремити задану гибридому від присутніх в системі окремих кліток, що не злилися, і від гібридів іншого складу або іншої специфічності, чим потрібні.

Для досягнення цієї мети автори методики розробили спеціальну схему, що використовує відбір кліток в селектирующей середовищі. Перш за все, був отриманий особливий мутант мишачої плазмоцитоми, зростання якого можна було контролювати складом живильного середовища. Для отримання мутанта використовували особливості синтезу нуклеїнових кислот (ДНК і РНК), наявних у всіх клітках і необхідних для їх існування. Відомо, що є два шляхи синтезу попередників нуклеїнових кислот: основний і резервний. Основний - це шлях новоутворення нуклеотидов, ланок, що входять до складу нуклеїнових кислот. Цей шлях включає декілька етапів і блокується протипухлинним препаратом аминоптерином (А). Проте клітки не гинуть від цього препарату, оскільки володіють резервними шляхом - здатністю синтезувати нуклеотиды і нуклеїнові кислоти, реутилизируя продукти розпаду раніше синтезованих нуклеїнових кислот: гипоксантина (Г) і тимидина (Т). Додавання Г і Т в живильне середовище, що містить А, знімає токсичний ефект останнього.

Для селекції гибридом треба було отримати мутант плазмоцитоми, не здатний користуватися резервним шляхом і, отже, що гине в середовищі, що містить Г, Т і А (ГАТ-среда). Такий мутант отримали шляхом додавання в середу токсичних аналогів Г і Т. Все клітки, здатні засвоювати Г і Т, включали їх токсичні аналоги і гинули. Виживали лише ті рідкісні мутанти, які були нездібні засвоювати Г і Т, тобто були позбавлені резервного шляху. З потомства цих кліток додатково відбирали ще і такі мутанти, які втратили здібність до синтезу власних імуноглобулінів. Тепер все було готово для отримання гибридом, тобто гібридів нормальних АОК і плазмоцитомных кліток. Мишей інтенсивно імунізували певним матеріалом - білком, бактерійною кліткою або кліткою тваринного походження. Коли в їх крові з'являлися антитіла, у них брали селезінку і лімфатичні вузли (місця скупчення АОК), і з них готували суспензію кліток. До неї додавали в надлишку клітки плазмоцитоми мутанта і полиэтиленгликоль (ПЕГ). Після короткої інкубації, потрібної для злиття кліток, їх відмивали від Пега і поміщали в середу, що містить Г, Т і А (ГАТ-среда). Тепер в системі знаходилися гібриди АОК і АОК, АОК і плазмоцитоми, а також що залишилися вільними АОК і клітки плазмоцитоми. З них потрібно було відібрати тільки гібриди АОК і плазмоцитоми. Після недовгого (декілька днів) культивування одиночні АОК, а також гібриди АОК і АОК гинули, оскільки нормальні клітки смертні і швидко гинуть в культурі. Плазмоцитомниє клітки і їх гібриди також гинули, оскільки А блокував основний шлях синтезу попередників нуклеїнових кислот, а Г і Т їх не рятували. Виживали, отже, тільки гібриди АОК і плазматичних кліток, оскільки безсмертя вони успадкували від плазмоцитоми, а резервний шлях - від нормальної клітки. Такі гібриди, гибридомы, зберігали здатність синтезувати і секретировать антитіла.

Наступний етап після отримання гибридом - клонування і відбір потрібних клонів. Що вижили в ГАТ клітки розсівали в спеціальні пластикові планшети, що містять звичайні 96 лунок ємкістю приблизно по 0,2 см2. У кожну лунку поміщали в середньому по 10 гибридомных кліток, які культивували у присутності «годуючих» кліток, що не мають відношення до гибридомам, але сприяючих їх зростанню. Після декількох днів культивування вміст кожної лунки перевіряли на присутність антитіл потрібної специфічності. Для цього використовували мікрометоди виявлення антитіл до відповідного антигена. Клітки з лунок, що містять потрібні антитіла, клонували, тобто повторно розсівали по таких же лунках, але з розрахунку 1 клітка на лунку, знов культивували і перевіряли на присутність потрібних антитіл. Процедуру повторювали 1-2 рази. Таким чином, відбирали клони, що продукують антитіла тільки одній потрібної специфічності, тобто моноклональні антитіла. Отримані клони можна заморозити при – 700 З і зберігати до того, поки їх не буде потрібно. Їх можна культивувати і накопичувати антитіла в культуральному середовищі, а можна прищепити мишам (оскільки гибридомы - це пухлинні клітки), де вони будуть рости, і накопичувати колосальні кількості моноклональних антитіл. Від однієї мишки можна отримати антитіл не менше, ніж від кролика. Ці антитіла не містять сторонніх антитіл і настільки однорідні физико-хімічний, що можуть розглядатися як чисті хімічні реактиви.

Звичайні поликлональные антитіла давно і широко застосовуються для визначення біологічно активних речовин - білків крові і інших біологічних рідин, гормонів, ростових чинників, клітинних рецепторів, медіаторів запалення і імунітету, бактерійних і вірусних антигенів, різних отрут і тому подібне Моноклональні антитіла із-за високої специфічності, стандартності і технологічності отримання успішно витісняють і замінюють імунні сироватки.

Далі гибридомы створюють унікальні можливості в аналітичних цілях: їх можна застосовувати як «імунологічний мікроскоп» з надзвичайно високим дозволом. Так, наприклад, якщо потрібно порівняти дві клітинні лінії, що відрізняються одним або небагатьма антигенами, і треба виявити такі антигени, то метод гибридом надає для цього виняткові можливості. Проїммунізіровав мишей однієї з ліній і отримавши сотні гибридом, що продукують антитіла до антигенів цієї лінії, можна знайти одну або дві з антитілами тільки до даної лінії. Розмноживши таку гибридому в пробірці або виростивши її на мишах, можна отримати величезну кількість антитіл до унікального антигена (або детерминантной групі), загубленого серед інших компонентів клітки подібно до голки в стозі сіна. Це буде продукт одного клона. У крові імунізованої тварини серед безлічі інших антитіл він ніяк не виявиться із-за чисто кількісних відносин. Завдяки гибридомам його можна не тільки виявити, але і вивести в лінію і отримати будь-яку кількість відповідних антитіл. За допомогою гибридом можна виявити антигени, характерні для пухлин певних тканин, отримати до них антитіла і використовувати їх для діагностики і типирования пухлин. Такі моноклональні антитіла знайшли широке застосування в онкологічні