Регуляція клітинного циклу. Апоптоз. Онкогенетика.

 

Мітотічеський цикл і його регуляція. Роль циклинов і циклинзависимых киназ. Принципи передачі митогенного сигналу. Роль чинників зростання, интегринов і кадгеринов. Контрольні точки митотического циклу. Апоптоз.

Генетичні механізми канцерогенезу. Загальна характеристика генів, що беруть участь в канцерогенезі: вірусні онкогены, протоонкогены, гены-супрессоры пухлин, гени-мутатори. Канцерогенні чинники.

 

Мітотічеський цикл і його регуляція. Здавалося б, давно відома річ – фази циклу (G1, S, G2, M), стадії митоза (профаза, метафаза, анафаза і телофаза), - все вже сто років як описано і вивчено.

Але що примушує клітку «рухатися» по цьому кругу? Як вдається їй забезпечити строго впорядковану зміну безлічі подій, складових клітинний цикл? Які механізми запускають, наприклад, синтез ДНК в S-фазе, а потім під час його зупиняють, попереджаючи повторне подвоєння ДНК? Як і чому відбувається руйнування ядерної оболонки в пізніше профазе, а потім освіта відразу два таких оболонок в телофазе? І так далі – подібні питання доречні відносно кожного процесу.

Довгий час все це було досконало неясно. І лише завдяки дослідженням останніх років перед нашим поглядом почала проступати, з одного боку, надзвичайно дивовижна (по своїй складності і «продуманості»), а з іншого боку, цілком природна картина під назвою «Регуляція клітинного циклу».

Впродовж клітинного циклу різні клітки можуть вступати в різні процеси.

Дійсно, клітки, що діляться, можуть не тільки продовжувати ділитися або тимчасово припинити ділення, впавши в «сплячку» (як буває із стволовими клітинами). Їх доля, залежно від цілого ряду обставин (генетичної програми, дії гистогормонов, вплив інших внутрішніх і зовнішніх чинників), може дуже круто змінитися. Ось найбільш драматичні варіанти:

- клітка вступає в процес диференціювання

- у клітці запускаються механізми самознищення (апоптоза)

- клітка піддається бласттрансформации, тобто перетворюється на пухлинну клітку.

Все це процеси надзвичайної біологічної важливості. І те, в який саме з них вступить клітка, що ділиться, визначається в ході клітинного циклу.

Тривалість клітинного циклу змінюється залежно від типу клітки і стадії розвитку організму. Наприклад, клітинний цикл заплідненого яйця дуже нетривалий. Запліднене яйце жаби ділиться дуже швидко (близько 30 хвилин). Велику частину цього часу займають S і М фази, а на фази G1 і G2 витрачається дуже мало часу. Оскільки в яйці вже існує великий запас білків і інших речовин, необхідних для клітинного ділення, синтезу нових білків майже не вимагається. Таким чином, G1,2- фази коротшають.

На ранніх стадіях розвитку необхідно сформувати якомога більше кліток відносно короткий проміжок часу. Наприклад, в заплідненому яйці жаби протягом 6 годин відбувається 12 дроблень і утворюється ембріон з 8192 кліток. Клітини діляться швидко, але збільшуються в розмірах трохи. Проте, за рахунок величезної кількості кліток і деякій ассиметрии ділення, ембріон формується протягом декількох годинників. Після того, як ембріон сформований, і закладка трьох основних типів тканини завершена, час, необхідний для клітинного циклу, збільшується за рахунок подовження G-фаз. Синтез нових білків приводить до того, що клітка збільшується в розмірі і об'ємі.

Клітинний цикл заплідненого яйця людини, на відміну від яйця жаби, триває значно довше. Перше ділення триває 30 годин, а весь процес дроблення – 7 діб (у жаби – 6 годин).

Проте зразкова тривалість стадій циклу для кліток людини, що швидко діляться, складає:

S-период – 10 ч

G2-период – 4,5 ч

М-період – 0,5 ч

G1-период – 9 ч.

Разом – 24 ч (рис.42.). Але, зрозуміло, це дуже приблизні оцінки, і для якихось кліток цикл може бути тривалішим. Зокрема наголошувалося, що для сперматогоний S-период триває 15 годин. І, відповідно, в 1,5 разу більше опиняється біля них тривалість циклу – приблизно 1,5 діб. Отже на 10 митотических ділень сперматогоний (що відбуваються на першому етапі сперматогенезу) потрібний 2 тижні.

 

 

Ріс.42. Клітинний цикл: митоз і цитокинез (клітинне ділення) складають М-фазу циклу, кульмінацією, якою є утворення двох дочірніх кліток. Кожна дочірня клітка вступає в G1-период интерфазы і може почати новий клітинний цикл. За періодом G1 слідує S-фаза, під час якої ДНК і хромосоми дуплицируются, і далі – фаза G2_. Початок митоза означає кінець интерфазы. Клітки, що покояться, затримуються у фазі G1 і, як то кажуть, знаходяться у фазі G0_. Зазвичай эукариотические клітки, які не зупинилися у фазі G0_, завершують цикл за 24 ч.

 

Роль циклинов і циклинзависимых киназ. Дослідження митотического циклу показали, що ключову роль в почерговій зміні його фаз грають спеціальні протеинкиназы - тобто циклинзависимые киназы (Cdks - cyclin-dependent kinasis). Кожна з них фосфорилирует певні білки, залучені у відповідну фазу циклу, і таким чином активує або інгібірує їх.

Молекула будь-якої Cdk складається лише з однієї субъединицы, яка сама по собі неактивна. Для активації ж Cdk потрібне пов'язання з нею спеціального білка - циклина (Ц). Є декілька разных циклинов, і, як вважають, що зв'язався з Cdk циклин не тільки активує фермент, але і додає йому субстратную специфічність відносно тих або інших білків.

Термін циклин відображає той факт, що концентрації циклинов в клітці протягом клітинного циклу змінюються циклічним чином (рис.43).

У активній формі протеинкиназы є гетеродимерные комплексами циклин-Cdk (Ц-cdk), де циклин служить активаторной, а Cdk - каталітичною субъединицей. Дані утворення не розглядають як єдині молекули, а називають комплексами, через те, що можуть бути різні поєднання конкретних циклинов і конкретних Cdk, причому кожне таке поєднання характерне для строго певної фази циклу.

Запускають цикл комплекси циклинD-Cdk4 і (або) циклинD-Cdk6. Разниє циклины позначаються латинськими буквами, а разные Cdk - арабськими цифрами. Названі комплекси функціонують на початковій стадії постмитотического (G1) періоду і, викликаючи відповідні внутріклітинні події, сприяють переходу кліткою «точки рестрикції» (крапка, передуюча S-периоду, тобто для кліток, що постійно діляться, знаходиться десь в кінці G1-периода, а для клітки, початкуючої ділення після перерви, десь в кінці Go -периода). Аналогічно, ті ж комплекси приводять до повернення «сплячої» Go -клетки в митотический цикл.

Друга половина G1 -происходит під впливом комплексу циклин E-Cdk2, що управляє.

У наступному - синтетичному (S) - періоді функціонуюча циклинзависимая киназа залишається тій же (Cdk2), але вона двічі міняє своїх циклиновых партнерів - ними послідовно стають циклин А і циклин Ст. Відповідно, міняються і ті білкові субстрати, на які діють Cdk2.

У премитотическом (G2) періоді останній з вищеназваних циклинов (В) зв'язується з іншою Cdk - Cdkl. Саме комплекс циклин B-Cdkl «вводить» клітку в митоз і «керує» цим складним процесом. Тому його ще називають митоз-стимулирующим чинником - MPF (від mitosis-promoting factor).

З складу останніх двох комплексів виходить, що їх
субстратная специфічність визначається не тільки циклином, але і самій Cdk, а найвірніше – одночасно тим і іншим, тобто наявним поєднанням циклина з Cdk.

Cdk1 нерідко позначається інакше - Cdk2. Річ у тому, що мутації гена Cdkl, порушуючи клітинний цикл, викликають у дріжджів фенотип виду Сdc2 (при якому клітки стають незвичайно довгими). Тому, ще до ідентифікації функції цього гена, він був позначений як Сdc2.

 

 

Ріс.43. Схема динаміки клітинного циклу

 

Отже, вся різноманітність подій клітинного циклу управляється відносно невеликим числом комплексів циклинов і Cdk.

Способи регуляції і активності Cdks. Зважаючи на виняткову функцію циклинзависимых киназ (Cdks), їх зміст і особливо активність знаходиться під складним контролем. Ось принципові способи цього контролю.

1. Регуляція синтезу Cdks. Мабуть, не все Cdks одночасно присутні в клітці на різних стадіях її циклу. Тому дуже важливим моментом є активація гена тій або інший Cdk.

Так, відомо, що комплекси G1 періоду (циклин D-Cdk4,6 і циклин E-Cdk2), крім інших численних дій, запускають транскрипцію гена киназы Cdkl. Остання ж необхідна для утворення комплексу G2- періоду і митоза (циклин B-Cdkl або MPF). Таким чином, про синтез компонентів даного комплексу клітка «піклується» завчасно, ще до реплікації ДНК.

2. Регуляція активності Cdks. Способи цієї регуляції достатньо різноманітні.

а) Один з них - пов'язання з якою-небудь Cdk активаторной
субъединицы - циклина.

б) Другий спосіб - скріплення (або тільки з Cdk, або зі всім комплексом циклин-Cdk) ингибиторной субъединицы. В ролі останньої виступають спеціальні білки (р15, р16, р21, р27, р57). Відомо, принаймні, два сімейства таких білків. Білки сімейства INK4 (р15 і р16) зв'язуються з Cdk4,6 і тим самим перешкоджають утворенню комплексів (циклин D-Cdk4,6), що запускають клітинний цикл. Білки другого сімейства, KIP1 (р21,р27, р57), зв'язуються з вже сформованими комплексами - і це теж приводить до ефекту, що інгібірує.

с) Третій спосіб контролю активності Cdks - це їх фосфорилування і дефосфорилирование. Тобто дані протеинкиназы (Cdks) самі здатні регулюватися тим же самим способом, яким вони управляють активністю «підвідомчих» ним білків.

Фосфорилування по одних локусам Cdk володіє активуючою дією; фосфорилування інших ділянок, навпаки, інгібірує фермент.

Але активність киназ відновлюється під дією специфічної фосфатази, що кодується геном cdc25a. З позначення виходить, що це ще один ген, мутація якого у дріжджів приводить до порушення клітинного циклу і фенотипу cdc.

Виявлені також дві тирозинкиназы (ТК), що інгібірують іншу Cdk, - Cdkl; одна з цих ТК, мабуть, діє на вільну Cdkl, а інша - на весь комплекс циклин В -Cdkl.

3. Регуляція синтезу і розпаду активаторів і інгібіторів Cdks. Як приклад звернемося спочатку до циклинам.

а) Багато митогенные чинників, «спонукаючи» клітку до ділення, запускають такі регуляторні ланцюги, які, врешті-решт, активують ген циклина D (крім багатьох інших дій). На наступних стадіях клітинного циклу стимулюється синтез чергових циклинов і так далі

б) Украй интересным є також управління розпадом циклинов. Воно здійснюється за допомогою убиквитин залежного механізму, який використовується для короткоживучих білків.

Найчіткіше роль цього механізму показана для циклина В, комплексу циклин, що бере участь в освіті, В - Cdk2 і митоз-стимулирующего чинника (MPF, він же комплекс циклин B-Cdkl). Фосфоріліруя певні білки, MPF стимулює входження клітки в митоз. Але для завершення митоза необхідні багато в чому прямо протилежні події. Тобто зміст MPF повинен знижуватися. Це досягається за допомогою швидкого розпаду циклина Ст.

Зразкова послідовність подій. Максимальної активності комплекс MPF досягає в метафазі митоза. В цей час він фосфорилирует, крім інших білків, так званий чинник АРС (аnaphase-promotoring complex) тобто чинник, що забезпечує анафазу. А даний чинник є нічим іншим, як убиквитинлигазой, специфічною відносно MPF. Тому він починає послідовно приєднувати (одну за іншою) молекули убиквитина до циклину В. Меченний таким чином циклин В швидко руйнується в протеосомах. У результаті зміст комплексу циклин B-Cdkl значно знижується, і в клітці благополучно здійснюються події анафазы, а потім і телофазы. Потім в G1-периоде чинник АРС инактивируется, від чого швидкість розпаду циклина В знижується, і даний циклин починає накопичуватися в клітці.

в) Контроль за синтезом речовин, Cdks, що інгібірують (або комплекси циклин-Cdk). Регуляція синтезу часто використовується позаклітинними эффекторами для впливу на клітинний цикл - стимуляції або гальмування проліферації. Один з прикладів: у деяких регуляторних внутріклітинних ланцюжках фігурують білки сімейства Smad. Ці білки, утворюючи відповідні чинники транскрипцій, стимулюють синтез інгібіторів р15, р21 і ін. У результаті активність комплексів G1-периода гальмується і клітка припиняє ділення.

Принципи передачі митогенного сигналу. Практично всі сигнальні шляхи, регулюючі проліферацію кліток, «націлені» на комплекси G1-периода — в основному, циклин D—Cdk4,6 і, у меншій мірі, циклин Е—cdk2. Це і зрозуміло: як вже наголошувалося, саме дані комплекси «запускають» черговий клітинний цикл.

Розглянемо два митогенных сигнальних шляху. Один з них відноситься до стволових клітин епітелію і починається з скріплення ЕФР — епідермального чинника зростання.

Другий шлях активується в Т-хелперах після їх взаємодії з АПК — антигенпредставляющими клітками.

Тепер на цих же двох прикладах покажемо «вихід» подібних шляхів на комплекси циклин-Cdk.

У обох випадках зовнішній сигнал приводить до активації
тирозинкиназы, що асоціюється з рецептором. Це веде (через ті або інші посередники) до запуску каскадів митогенактивируемых протеинкиназ (МАПК). Кінцеві ферменти даного каскаду, фосфорилируя ряд чинників (Elk, Ets, ATF2, Tcf і ін.) транскрипцій, активують їх, а через них — і т.з. гени ранньої відповіді (FOS, JUN). У культурі кліток вже через 30 мін після початку дії митогена активність цих генів досягає максимального
рівня.

Продукти сімейств генів FOS і JUN — це знову-таки
чинники транскрипцій, але специфічні вже відносно інших генів — т.з. генів сповільненої відповіді. Тому через деякий час починається експресія цих генів.

Серед останніх-то і знаходяться наші «знайомі» — гени циклина D, Cdk4 і Cdk6, тобто компонентів комплексів циклин-Cdk, специфічних для першої половини G1 - періоду циклу.

Крім того, активуються ще деякі гени і серед них — ген білка Мус. Після свого синтезу білок Мус, у свою чергу, впливає на активність ряду генів. Так, він гальмує експресію гена білка р27 — інгібітору цілого ряду комплексів циклин- Cdk. І одночасно білок Мус активує ген Cdc25a, який кодує специфічну фосфатазу. Остання дефосфорилирует Cdk4 і Cdk2, що приводить до їх активації.

В результаті ми отримуємо наступні ефекти:

збільшення вмісту в клітці циклина D і реагуючих з ним киназ — Cdk4, Cdk6;

зниження змісту ряду інгібіторів Cdks;

підвищення активності (в результаті дефосфорилирования) тих же циклинзависимых киназ (Cdk4, Cdk6), а також Cdk2.

Все це і забезпечує формування в клітці достатньої кількості активних комплексів циклин D—Cdk4,6, початківців готувати клітку до ділення.

Відмітимо, щоб розглянуті сигнальні шляхи «спрацювали», необхідна одна умова: клітка повинна бути фіксована на якому-небудь позаклітинному матриксі.

Дія антимитогенов. Це дія ФНО (чинника некрозу пухлин) на пухлинні клітки. ФНО «запускає» в клітках відразу декілька сигнальних шляхів, і серед них один містить ферментативный каскад МАПК. Тільки тепер збудження відповідного рецептора через ряд посередників (серед яких — сфингозин і ПК-С) приводить до гальмування МАПК. Далі — все як в попередніх шляхах, але з протилежним знаком. Отже, у результаті в клітці різко знижуватиметься кількість активних комплексів циклин D—Cdk4,6, внаслідок чого ділення припиняться. Дія ж ФНО через інші сигнальні шляхи ініціюватиме апоптоз.

Другий приклад: мова йде про Тфрр — трансформуючому чиннику зростання. Вже наголошувалося, що він пригноблює проліферацію багатьох кліток. Рецептори Тфрр, мабуть, схожі по структурі з рецепторами ЕФР (епідермального чинника зростання). Це означає, що при скріпленні свого лиганда рецепторні субъединицы об'єднуються в димерные структури, домени цитоплазми кожної субъединицы володіють тирозинкиназной активністю, в активованому стані ці домени фосфорилируют один одного. Відмінність полягає лише в тому, що в даному випадку модифіковані домени рецептора зв'язують інший комплекс білків цитоплазми: тепер це комплекс Smad2+Smad3. Він теж фосфорилируется рецепторною тирозинкиназой, після чого набуває здатності зв'язувати третій білок — Smad4.

Потім весь цей потрійний комплекс диффундирует в ядро і виконує роль чинника транскрипції для генів, що кодують інгібітори Cdks. Маються на увазі такі білки, як р15 і р21.

Накопичення в клітці цих інгібіторів і приводить до гальмування проліферації.

Роль чинників зростання, интегринов і кадгеринов. Кліткам нижчих організмів для вступу до S-фазу клітинного циклу необхідна наявність живильних речовин в зовнішньому середовищі. При недоліку живильних речовин клітина не ділиться. У вищих організмів наявність живильних речовин зазвичай не є лімітуючим чинником. Проте сигнал, що ініціює ділення клітки, частіше буває зовнішнім, чим внутрішнім. Доказу цього були отримані в перших експериментах з культурою кліток ссавців in vitro.

При розробці методики вирощування кліток ссавців в культурі було відмічено, що клітки ростуть краще, якщо вони знаходяться усередині кров'яних згустків. Із-за незручності дослідження кліток, що ростуть, усередині згустка, після згортання крові згусток віддаляється. Рідина, що залишилася, відома як сироватка. Якщо видалити всі клітки до того, як кров згорнеться, і додати отриману сироватку до кліток, що ростуть, вона не підтримуватиме зростання. Це доводить, що при згортанні з кліток крові вивільняється якийсь чинник, необхідний для ділення клітин. Було показано, що ця речовина вивільняється з тромбоцитів, і воно було назване тромбоцитарным чинником зростання (PDGF). Виявляється, нормальні клітки ссавців містять достатню кількість живильних речовин для ділення. Таким чином, в клітки повинен поступати додатковий сигнал, стимулюючий проліферацію. У випадку з тромбоцитарным чинником зростання цей білок секретируется тромбоцитами при згортанні крові після утворенні рани. Для заповнення тканинного дефекту тромбоцитарный чинник зростання, один з головних чинників зростання організму, сигналізує навколишнім кліткам про необхідність приступити до ділення.

До теперішнього часу виділено і охарактеризовано велике число чинників зростання: тромбоцитариый чинник зростання; епідермальний чинник зростання (EGF); чинники зростання фибробластов (FGF) (мають дев'ять изоформ і володіють невеликою клітинною специфічністю, проте ще відносяться до групи малоспецифічних); чинник зростання нервів (NGF) (цей чинник зростання діє тільки на клітки нервової системи); эритропоэтин (ЕРО) (цей чинник зростання стимулює утворення еритроцитів в кістковому мозку); иитерлейкин-2 і інтерлейкін-3.

Всі ці чинники зростання діють в основному на специфічні клітки-мішені. Кожен чинник зростання є лигандом, який зв'язується із специфічним поверхневим рецептором клітки і ініціює процес передачі сигналу.

Більшість кліток ссавців знаходяться в особливій фазі клітинного циклу, званою Go-фазой або компартментом клітинного диференціювання. Ця фаза клітинного циклу є подовженою фазою G1. Це означає, що гени, що кодують білки, які запускають проліферацію кліток, знаходяться в «вимкненому» стані. У цьому положенні метаболічна енергія клітки витрачається на утворення спеціалізованих білків, необхідних для здійснення диференціювання. Таким чином, гени, що кодують ці білки, знаходяться в «включеному» стані.

У більшості типів кліток гени для клітинної проліферації можуть бути включені знову. Проте в деяких клітках гени проліферації ніколи не запускаються повторно після виключення. При завершенні проліферації в клітках серцевого м'яза Cdk і циклины вимикаються і більше ніколи не включаються. То ж справедливо і для всіх типів нейронів.

Проте у відповідних умовах багато кліток можуть повернутися в цикл ділення. Практично у всіх тканинах організму відбуваються клітинні «перетворення». Зазвичай такі перетворення відбуваються рідко. Виняток становлять клітки крові і кишкового епітелію, в яких швидкість оновлення кліток дуже висока.

Як показано вище, один з основних типів сигналів, активуючих Cdk і циклины, генерують чинники зростання. Проте, навіть отримавши такий сигнал, організм повинен регулювати відповідь так, щоб підтримувати кількість і просторову організацію кліток. Якщо цього не відбувається, наступають летальні зміни організму.

При дослідженні нормальних кліток, вирощених в культурі тканини, було показано, що існують різні чинники, що визначають число кліток, необхідних для підтримки архітектури тканини, і якість з'єднання кліток з базальною мембраною. Якщо вирощувані в культурі фибробласты заповнюють всю чашку Петрі, вони перестають ділитися і, очевидно, йдуть в псевдо-Со-фазу. Якщо в стерильних умовах по поверхні культури провести шпателем діагональну лінію, клітки, розташовані на цій лінії, гинуть і залишається бесклеточная діагональ. Клітки, що знаходяться на краю «рани», починають негайно ділитися і пролиферировать, заповнюючи вільний простір. Як тільки простір заповнений, ділення знову припиняється.

На основі цього спостереження був зроблений вивід про те, що нормальні клітини діляться до досягнення певної щільності. Після утворення контактів з іншими клітками на субстраті, всередину клітки передається сигнал про те, що всі контактні крапки зайняті, і гени, що запускають проліферацію, вимикаються.

Якщо клітці не давати стикнутися з поверхнею тарілки, вона зберігає округлу форму і не вступає в митоз. Якщо ж клітка стикається з поверхнею і розплющується, вона формує з поверхнею тарілки контакти, звані фокальними контактами і фокальними адгезионными пластинками. До складу фокальної адгезионной пластинки входять важливі компоненти цитоскелета, включаючи актиновые филаменты, мікротрубочки і інші структурні білки. Через деякий час ці клітки вступають в митоз.

Результати цих і аналогічних експериментів доводять, що молекули навколишнього середовища, що наприклад входять до складу міжклітинних контактів і контактів кліток з міжклітинною речовиною, беруть участь в управлінні клітинною проліферацією.

Тепер розглянемо такі сигнальні шляхи, які починаються від адгезивних мембранних білків. Одні з цих шляхів стимулюють проліферацію кліток; інші, навпаки, гальмують.

Багато кліток здатні ділитися, тільки будучи прикріпленими до позаклітинної структури – базальної мембрани (эпителиоциты), колагеновим волокнам (фибробласты) і так далі

Інформація ж про зв'язок клітки з такою структурою поступає від интегринов. Це адгезивні білки з двома нерівними субъединицами.

При пов'язанні з позаклітинним матриксом менша (р-) субъединица интегрина активує одну з тирозинкиназ — FAK (Focal Adhesion Kinase), а та, у свою чергу, ще одну тирозинкиназу — Src. Остання відноситься до класу нерецепторних тирозинкиназ, оскільки не входить до складу рецепторного комплексу і навіть не взаємодіє безпосередньо з рецепторами.

Безпосереднім субстратом Src є білок SHC, який пов'язує даний сигнальний шлях (що йде від интегринов) з сигнальними шляхами від рецепторів митогенов. Загальною ж частиною останніх доріг є багато разів згадувані вище каскади МАПК (митогенактивируемых протеинкиназ). Отже, адаптерний білок SHC повинен стимулювати проходження сигналу по даних каскадах.

Проте не цілком ясно, який саме член каскадів активується білком SHC. Є припущення, що це той же комплекс білків (GRB, SOS, Ras, Raf), що і у разі дії ЕФР (епідермального чинника зростання).

Але, на наш погляд, треба врахувати наступну обставину. Для того, щоб клітка ссавців почала ділитися, необхідне одночасне виконання двох умов: прикріплення клітки до якої-небудь поверхні і дія на неї ростового чинника.

Причому в неприкріпленій клітці проходження сигналу від ростового чинника блокується на одній з МАПК, а конкретно — на киназе МЕК (Мек1).

Звідси витікає, що:

а) сигнал від интегринов йде саме до цієї ланки МАПК — киназе МЕК;

б) дана киназа активується тільки при дії на неї відразу двох білків: попередньої киназы з сімейства МАПК і білка SHC (після дії на нього Src).

Тоді і виходить, що сигнали від ростового чинника і интегринов взаємно доповнюють один одного, а кожен з них окремо не здатний індукувати ділення клітки.

Ефект прикріплення клітки до опори включає ще одну важливу подію. Воно стосується «знаменитого» чинника транскрипції — білка р53.

Останній активує гени, що зупиняють ділення (зокрема, ген білка р21 — інгібітору комплексів циклин- Cdk), а також гени апоптоза. Тому недивно, що що йде від интегринов сигнал призводить до зниження вмісту в клітці такого «шкідливого» білка.

У разі білка р53 зазвичай регулюється не синтез, а розпад. Тому під дією сигналу від интегринов, мабуть, тим або іншим способом прискорюється протеолиз цього білка. За деякими даними, це може бути пов'язано із зниженням змісту іншого білка (ARF), що інгібірує розпад білка р53.

Контактне гальмування проліферації. Якщо ж клітка встановлює контакт не з позаклітинним матриксом, а з іншими клітками, то спостерігається ефект, прямо протилежний попередньому, — припинення ділень. Це позначається як контактне гальмування.

Після чергового пересівання кліток в плоску скляну судину («матрац») вони спочатку — протягом декількох годинників прикріпляються до дна судини і лише після цього входять в клітинний цикл (стимуляція ділень).

Коли ж на дні судини не залишається вільного місця і клітки вступають в контакт один з одним, ділення припиняються (контактне гальмування).

Сигнал про міжклітинний контакт, мабуть, йде від кадгеринов — адгезивних білків, що беруть участь в утворенні таких контактів. Ймовірно, у кадгеринов міняється при цьому конфігурація; тому їх домени цитоплазми набувають здатності зв'язувати білок р-катенин.

Припускають, що даний білок — чинник транскрипції. Коли він вільний від зв'язку з кадгерином (тобто коли клітка ще не контактує з іншими клітками), він утворює активний комплекс з ще одним чинником транскрипції — білком Tcf4. Комплекс мігрує в ядро і тут прямим або (швидше за все) опосередкованим способом стимулює транскрипцію генів циклина D і білка Мус.

Це знов ті самі гени, які активуються в раніше розглянутих сигнальних шляхах, — що йдуть від ростових чинників і від интегринов. Ті шляхи сходяться і взаємно доповнюють один одного на каскадах митогенактивируемых киназ (МАПК).

Але шлях, в-катенин, що містить, теж є необхідним для ділення. При уловлюванні в-катенина кадгерином ділення припиняються. Отже, цей шлях також необхідно доповнює попередні. На наш погляд, все пояснюється і встає на свої місця при наступних припущеннях:

· на початку будь-якого клітинного циклу повинен утворитися якийсь (завжди один і той же) промитотический комплекс чинників (ПМКТФ) транскрипцій, специфічний відносно генів ранньої відповіді;

· до складу цього комплексу входять в-катенин і білок Tcf4, що можливо лише тоді, коли в-катенин не зв'язаний кадгерином (немає міжклітинних контактів);

· крім того, комплекс містить чинники, що активуються каскадом МАПК; причому цей каскад сам, по попередньому нашому припущенню, вимагає подвійного сигналу від интегринов (клітка прикріплена до позаклітинної структури) і від ростового чинника.

У результаті число умов, необхідних для ділення клітки (в принципі здібною до ділення), зростає вже до трьох: це не тільки прикріплення до поверхні і дія ростового чинника, але і відсутність контактів з іншими клітками.

Лише при виконанні цих умов активуються гени ранньої відповіді, і запускається механізм клітинного циклу, зокрема, утворюється «друга черга» чинників транскрипцій, а потім і продукти стимульованих ними генів — циклин D, Cdk4,6 і так далі

Але цим перипетії внутріклітинних регуляторних шляхів, пов'язані з в-катенином, не вичерпуються. Встановлено ще, принаймні, два интересных факту.

а) Деградація в-катенина проводиться за допомогою убиквитинзависимого механізму. Причому як убиквитинлигазы (ферменту, переносячого убиквитин на Р-катенін) виступає вже знайомий нам чинник АРС, що забезпечує анафазу.

Останній виконує таку ж функцію відносно циклинов, необхідних для входження клітки в цикл. Тому немає нічого дивовижного, що одночасно з даними циклинами руйнується і чинник транскрипції, потрібний для їх синтезу. Відбувається ж це в метафазі і анафазе митоза, коли АРС активується шляхом фосфорилування.

За деякими даними, перед взаємодією з АРС в-катенин теж повинен піддатися фосфорилуванню — киназой-ЗР-гликогенсинтетазы (GSK-3P), яка, у свою чергу, знаходиться під контролем ряду білків.

Така «підвищена увага» з боку клітки до в-катенину — непряме свідоцтво його ключовій ролі в запуску ділення. Це цілком узгоджується з припущенням, що в-катенин — необхідний компонент універсального комплексу транскрипції, початківця клітинний цикл при будь-якому митогенном стимулі.

б) Другий факт полягає в тому, що при контактному гальмуванні в клітці збільшується зміст білка р53. Це теж виглядає цілком природно, якщо вважати, що все той же комплекс чинників транскрипцій, крім іншого, прискорює розпад білка р53, вимикаючи ген білка ARF — інгібітору протеолиза білка р53.

Звичайно, відомо тут ще далеко не все. Але про принцип роботи і деякі деталі цього чудового механізму вже можна сказати.

Що стосується принципу роботи, то він достатньо простий і очевидний. Комплекс циклин-Cdk чергової стадії циклу, як правило, повинен забезпечити три процеси:

а) «виведення з гри» комплексу попередньої стадії

б) стимуляцію подій «своєї» стадії

в) утворення (або активацію) комплексу наступної стадії.

Виходить свого роду «ланцюговий» механізм, після включення, якого кожна стадія процесу готує умови для переходу до наступної стадії. Поза сумнівом, такий же принцип багатьох інших складних біологічних процесів — таких, як ембріональний розвиток, диференціювання, регенерація.

Подивимося тепер, як конкретно реалізується цей принцип у разі клітинного циклу.

Контрольні точки митотического циклу. (Білок р53, мікротрубочки: зв'язок з клінікою). Точна реплікація і розподіл генетичного матеріалу — це найважливіші умови виживання клітки. У клітинному циклі існують чотири крапки, в яких точність реплікації, правильність послідовності і рівне розділення ДНК контролюються спеціальними клітинними механізмами.

A. Контрольна точка фази G1. Якщо у фазі G1 виявляється пошкодження ДНК, білок р53 виступає в ролі чинника транскрипції і викликає затримку кліток в G1. Нестабільний р53 зазвичай швидко руйнується. Проте, коли в клітці з'являється аномальна ДНК, білок р53 стабілізується і приєднується до цієї ДНК. В результаті р53 накопичується в ядрі і стимулює експресію білка, Cdk2, що інгібірує.

Клітка затримується у фазі G1 до тих пір, поки пошкоджені нуклеотиды не будуть відновлені ферментами репарації. Затримка у фазі G1 запобігає копіюванню пошкоджених підстав і гальмує мутацію ДНК. При відщеплюванні білка р53 від ДНК його концентрація знижується; інгібітор Cdk відділяється, і Cdk починає экспрессироваться.

У клітках багатьох метастатичних пухлин людини обидва аллеля р53 неактивні. У таких клітках порушений нормальний контроль, здійснюваний р53, і пошкоджена ДНК може реплицироваться. В деяких випадках це приводить до метастатичної трансформації пухлин.

Б. Контрольная точка S-фазы функціонує у фазі S, коли реплицируется ДНК. Поява мутацій в процесі реплікації і їх подальше вбудовування в геном може викликати серйозні наслідки, включаючи загибель клітки. Якщо відбулися помилки в реплікації, (що трапляється) і якщо вони були пропущені репаративными ферментами, клітка не може вийти з S-фазы. Перевірка точної реплікації ДНК — найважливіша регуляторна точка клітки.

B. Контрольна точка С2-фази. Нерепліцированная ДНК блокує перехід клітки від С2 -фазы до М-фази. Відбувається катастрофічне пошкодження, якщо клітка проходить через фазу циклу, незавершив молекулярні процеси, необхідні для підготовки до ділення. Наприклад, при введенні MPF в клітки, що знаходяться в S-фазе, неповністю реплицированные хромосоми конденсуються, а потім фрагментуються.

Г. Контрольная точка М-фази. Причиною зупинки циклу в даній крапці може бути неправильна збірка веретена ділення. Наприклад, неприкріплення кинетохоры какой- або хроматиды до мікротрубочок веретена ділення. Мікротрубочки (МКТ) постійно полімеризуються і деполимеризуются. Під час митоза відбуваються різкі і непередбачувані переходи МКТ з того, що росте (полімеризація) в стан, що скорочується (деполимеризация), - це катастрофа і назад – це порятунок. Медикаментозна терапія онкологічних хворих полягає в руйнуванні митотического веретена колхицином, винбластином і винкристином, які порушують полімеризацію МКТ.

Залежно від результатів «перевірки», вибирається один з трьох варіантів:

а) безупинний перехід до наступної стадії циклу;

б) затримка на поточній стадії для виправлення виявлених дефектів;

в) запуск механізму апоптоза, якщо виявлені порушення непоправні.

У більшості, якщо не у всіх, випадках хромосомних пошкоджень центральну роль в зупинці циклу грає білок р53.

Роль білка р53 («Вартовий генома», «Диспетчер апоптоза», Пухлинний супрессор). Білок р53 контролює виключно важливі клітинні процеси і, завдяки цьому, залучений у велику кількість всіляких регуляторних ланцюгів. Він (або його ген) активується у відповідь на різноманітні пошкодження клітинної структури: нерепарированные розриви і інші пошкодження ДНК, порушення розбіжності хромосом в митозе, руйнування мікротрубочок і так далі

Сам же білок р53 регулює активність, принаймні, трьох груп генів:

1) активує гени (Р21, GADD45 та інші), що відповідають за зупинку клітинного ділення;

2) активує гени (BAX, KILLER/DR5, PIG та інші), запускаючі апоптоз – процес, ведучий, шляхом активації спеціальних ферментів, до загибелі клітки; а так само репресує гени (BCL2, RELA), стримуючі апоптоз;

3) активує гени (TSP1, BAI1 та інші), гальмуючі ангиогенез (утворення нових судин).

У результаті через посередництво білка р53 клітка у відповідь на пошкодження своєї структури

- або затримується на тій або іншій стадії митотического циклу і виправляє ці пошкодження;

- або (при неможливості виправлень) взагалі припиняє ділення і вступає в процес клітинного старіння (фаза III по Хейфліку);

- або (при потенційній небезпеці пошкодженої клітки для її оточення) здійснює апоптоз, т. е., просто кажучи, самогубство.

Зокрема, апоптозу, крім інших, піддаються і клітки, в яких відбулася пухлинна трансформація. В зв'язку з цим зрозуміло, чому одночасно гальмується ангиогенез: це ще один спосіб обмеження пухлинного зростання.

Тому білок р53 – один з найбільш важливих пухлинних супрессоров. У більшості пухлин функції білка р53, що вже розвиваються, опиняються в тому або іншому відношенні порушені.

Така загальна біологічна роль білка р53, а зараз розглянемо деякі пов'язані з ним питання детальніше.

Білок р53 складається з 392 амінокислот, створюючих 6 доменів (мал. 44):

1) N-концевой домен активує ген білка р21 (інгібітор киназ), а так само інших білків, що зупиняють ділення клітки.

2) додатковий домен транскрипції для активації генів-мішеней.

3) гнучкий пролиновый домен проявляє супрессорную активність, запускає апоптоз.

4) центральний домен зв'язується з энхансерами. У цій ділянці мутації 5-8 экзонов приводять до онкогенезу.

5) б-спиральный домен відповідає за ядерну локалізацію р53 і утворення тетрамеров (мономери не активні).

6) С-концевой домен – мішень для модифікуючих ферментів (киназ, ацетилаз, гликозилаз).

 

 

 

Ріс.44. Білок р53

 

Якщо С-концевой домен не модифікований, центральний домен не здатний взаємодіяти з ДНК-мішенню. Модифікація ж С-домена не тільки додає білку р53 таку здатність, але і впливає на його специфічність. Річ у тому, що р53-зависимые энхансеры (що відносяться до різних генів) декілька розрізняються послідовністю нуклеотидных пар. І від виду модифікації С-домена залежить