Реплікація теломерных відділів ДНК.

1) Проблему сформулював А.М.Оловников в 1971 році тільки для лінійної ДНК – нові ланцюги виявляються укороченими з 5' кінців.

2) Недореплікация ДНК веде до старіння клітки.

ДНК – полимераза тільки подовжує 3' кінець вже наявного полінуклеотиду, а тут такого кінця просто немає – значить, новий ланцюг повинен бути декілька коротше старою. Утворюються гострі (50-65 н.п.) кінці ДНК, яка обрізається эндонуклеазами.

3) В середньому в 1 молекулі ОТРУТА-ДНК 120 млн. н.п., значить, укорочення ДНК за одне клітинне ділення складе ~ 0,00005%. Таким чином, якби кінці не відновлювалися, то через певну кількість ділень хромосоми взагалі зникли б!

Вирішення проблеми кінцевої недорепликации:

1) На кінцях хромосомної ДНК є гексануклеотидная послідовність без інформації:

5' ЦЦЦТАА > ТТАГГГ 3'

3' ГГГАТТ < < ААТЦЦЦ 5'

У 3' кінця ланцюга 5' ТТАГГГ 3' ці повтори у ембріона людини складають 10-15 тисяч н.п. (0,02%). Якщо втрачаються ці буферні ділянки, то це не відбивається на функції генома.

2) Подовження теломер за допомогою теломеразы (1984 р., Блекберн, Грайдер).

Подовжується старий ланцюг, довший (до обрізання гострого кінця!). До 3'-концу старого ланцюга пристроюються декілька сотень ТТАГГГ - повторів, які є матрицею для утворення ще одного фрагмента Оказаки.

3) Механізм ALT (альтернативний механізм) – без теломеразы у дрозофилы і деяких ракових кліток – рекомбінація між теломерными ділянками різних хромосом і подовження ДНК шляхом рекомбінації! Але роль ALT невелика!

Кінцева недорепликация ДНК.

Відомо, що ДНК-полимеразы, синтезуючи дочірній ланцюг ДНК, прочитує батьківський ланцюг в напрямі від її 3 – конца до 5 -концу. Відповідно дочірній ланцюг синтезується у напрямі 5' > 3'.

У протилежному напрямі синтез ланцюга ДНК фермент каталізувати не може. Крім того, ДНК-полимераза починає синтез тільки із спеціального Рнк-праймера — короткої РНК-затравки, комплементарної ДНК. Після закінчення синтезу ДНК Рнк-праймери віддаляються, а пропуски в одному з дочірніх ланцюгів ДНК заповнюються ДНК-полимеразой. Проте на 3'-конце ДНК такий пропуск заповнений бути не може, і тому 3'-концевые ділянки ДНК залишаються однотяжевыми, а їх 5'-концевые ділянки — недореплицированными. Звідси ясно, що кожен раунд реплікації хромосом приводитиме до їх укорочення. Зрозуміло, що, перш за все, повинна скорочуватися довжина теломерной ДНК.

Цим-то і пояснюється «ліміт Хейфліка», оскільки після того, як довжина теломерной ДНК стає загрозливо низькою, наступає період кризиса—неспособности клітки до подальшого ділення, а потім і її смерть. Хоча в культурах кліток in vitro клітки і гинуть від укорочення теломер, але для кліток in vivо нормального організму це практично неможливо. Так, згідно недавнім спостереженням Озави (1997) 89% мітохондріальній ДНК в мітохондріях серця 97- літнього старого містили обширні делеции, критичні для реплікації і транскрипції. Проте, ця людина померла не від серцевої недостатності, а від раки шлунку. Неважко уявити собі, що подальше наростання дисфункції мітохондріальної ДНК все ж таки привело б старого в недалекому майбутньому до смерті і це навряд чи мало відношення до укорочення ядерної ДНК.

Як наголошувалося, першим на проблему «кінцевої недорепликации ДНК» звернув увагу А.М. Оловников в 1971 році. Він висловив гіпотезу про те, що втрата кінцевих послідовностей ДНК унаслідок їх недорепликации веде до старіння клітки. Передбачалося, що процес укорочення теломер і є той годинниковий механізм, який визначає репликативный потенціал «смертної» клітки, і коли довжина теломер стає загрозливо короткою, цьому механізму запобігає подальше ділення клітки. А.М.Оловников припустив також, що в нестаріючих клітках (а до них окрім ракових відносяться зародкові, стволові і інші генеративные клітки) повинна існувати спеціалізована ферментативная система, яка контролює і підтримує довжину теломерной ДНК.

Гипотеза а.М. Оловникова знайшла переконливе підтвердження в подальші роки. По-перше, було встановлено, що теломеры нормальних (тобто приречених на старіння) кліток дійсно коротшають на 50-60 нуклеотидных ланок при кожному клітинному діленні. По-друге, в 1984 році Е. Блекберн і Е. Грайдер виділили фермент, який за допомогою механізму, відмінного від механізму реакцій, лежачих в основі реплікації ДНК, синтезує теломерную ДНК. Цей фермент був названий теломеразой. Отже, основне призначення теломеразы — синтезувати сегменти ДНК, з якої складається Г-ланцюг теломерной ДНК, що повторюються. Таким чином, вона відноситься до класу ДНК-полимераз, причому виявилось, що теломераза — це РНК-зависимая ДНК-полимераза або зворотна транскриптаза. Ферменти цього класу, що синтезують ДНК на РНК-матрицах, дуже добре відомі молекулярним біологам. Вони закодовані і містяться в ретровірусах (наприклад, у вірусі імунодефіциту людини, що викликає захворювання СНІДОМ) і служать для синтезу ДНК-копії їх геномів, який в ретровірусі представлений РНК. У клітинному геномі зворотні транскриптазы закодовані в ретротранспозонах.

РНК, використовувана теломеразой для синтезу теломерной ДНК як матриця, входить до складу цього ферменту. У цьому унікальність теломеразы: на сьогодні це єдина відома зворотна транскриптаза, що РНК-содержащая. Теломеразниє РНК у різних організмів сильно розрізняються по довжині і структурі.

Теломерази простих містять РНК завдовжки в 150—200 нуклеотидных залишків (н.о.), довжина теломеразной РНК людини — 450 н.о., тоді як теломераза дріжджів містить аномально довгу РНК (близько 1300 н.о.).

Матрична ділянка представлена в теломеразной РНК тільки один раз. Його довжина не перевищує довжину двох повторів в теломерной ДНК, яку він кодує і яким він комплементарен.

Оскільки теломераза синтезує сегменти ДНК, що повторюється багато раз, використовуючи тільки один сегмент своєї РНК, вона повинна володіти здатністю періодично (після завершення синтезу кожного повтору) переміщати (транслоцировать) матричну ділянку в район 3'-конца теломерной ДНК, що синтезується. Джерелом енергії для такого переміщення, мабуть, служить сама реакція синтезу ланцюга теломерной ДНК, оскільки дезоксинуклеозидтрифосфаты — субстрати цієї реакції — високоенергетичні речовини.

На першій стадії теломераза знаходить З'-конец теломерной ДНК, з яким частину матричної ділянки теломеразной РНК утворює комплементарний комплекс. При цьому теломераза використовує З'-конец хромосомної ДНК як праймера. Далі наступає черга РНК-зависимой ДНК-ПОЛІМЕРАЗНОЙ активності теломеразы.

 

 

Ріс.10. Механізм дії теломеразы

 

Вона забезпечується спеціальною субъединицей теломериразы, яка по пристрою свого каталітичного центру багато в чому схожа із зворотними транскриптазами ретровірусів і ретротранспозонов. Коли синтез ДНК-повтору закінчується, відбувається транслокация, тобто переміщення матриці і білкових субъединиц ферменту на наново синтезований кінець теломерной ДНК, і весь цикл повторюється знов (рис.10).

Це схемне уявлення є вельми умовним, оскільки для побудови теломер потрібний ще багато субъединиц, наприклад, ДНК, що відповідає за знаходження 3'-конца, або субъединицы, що відповідають за транслокацию, і так далі

Теломераза, рак і старіння. Розглянемо дані про довжину теломерной ДНК і активності теломеразы в різних клітках людини.

Висока теломеразная активність спостерігається в статевих клітках людини протягом всього його життя (табл.1). Відповідно їх теломеры складаються з найбільшого числа ДНК-повтору і містять всі необхідні білки для нормальної реплікації кліток.

 

Табл.1. Теломеразная активність різних кліток

 

Тип кліток	Теломери, т.п.н.	Теломеразная активність
Статеві Соматичні     Ракові	15-20 10-12 при народженні зменшуються з віком 4-6, 10-15	Висока Відсутній   Присутній в 80% випадків

 

 

Аналогічна ситуація спостерігається і для стволових клітин, які діляться необмежено довго. Проте у стволової клітини завжди є можливість дати дві дочірні клітки, одна з яких залишиться стволовою («безсмертною»), а інша вступить в процес диференціювання. Завдяки цьому стволові клітини служать постійним джерелом різноманітних кліток організму. Наприклад, стволові клітини кісткового мозку дають початок гемопоэзу — процесу утворення кліток крові, а з базальних кліток епідермісу походять різноманітні клітки шкірного покриву. Як тільки нащадки статевих або стволових кліток починають диференціюватися, активність теломеразы падає і їх теломеры починають коротшати. У клітках, диференціювання яких завершене, активність теломеразы падає до нуля, і з кожним клітинним діленням вони з неминучістю наближаються до стану сенесенса (перестають ділитися). Услід за цим наступає криза, і більшість кліток гинуть. Ця картина характерна для переважної більшості відомих культур кліток эукариот. Проте і тут є рідкісні, але важливі виключення: теломеразная активність виявляється в таких «смертних» клітках, як макрофаги і лейкоцити.

Недавно було встановлено, що нормальні соматичні клітки тому позбавлені теломеразной активності, що в них повністю пригнічена експресія гена її каталітичною субъединицы (зворотної транскриптазы). Інші ж складові теломеразы, включаючи теломеразную РНК, утворюються в цих клітках, хоча і в менших кількостях, чим в їх «безсмертних» прародителях, але постійно. Відкриття цього важливого факту Дж. Шєєм, В. Райтом і їх співробітниками і стало основою для сенсаційної роботи по подоланню «ліміту Хейфліка».

Порівняно невелика довжина теломер у більшості ракових кліток наводить на думку про те, що вони походять з нормальних кліток, достигнувших передкризового стану. Цей стан характеризується порушенням регуляції багатьох біохімічних реакцій. У таких клітках відбуваються численні хромосомні перебудови, які зокрема ведуть і до злоякісної трансформації. Більшість цих кліток гинуть, але в частині з них в результаті випадкових мутацій може активуватися постійна експресія генів теломеразы, яка підтримуватиме довжину теломер на рівні, необхідному і достатньому для їх функціонування.

Якийсь час викликав подив той факт, що приблизно п'ята частина проаналізованих ракових пухлин і кліток взагалі не містила активною теломеразы. Виявилось, проте, що довжина теломер в них підтримується на належному рівні. Таким чином, в цих клітках діє інший (не теломеразный, а швидше рекомбінаційний) механізм утворення теломерной ДНК. Іншими словами, такі клітки знаходяться в тому ж ряду виключень з правила, що і дрозофила.

Останнім часом проводиться багато робіт, аналогічних роботі Дж. Шия, Ст. Райта. Були повідомлення про те, що клітки з штучно активованими теломеразой подолали 220 циклів ділення. Останні повідомлення прийшло з Південно-західного Медичного Центру в Далласі; у нім мовиться, що вже 220 поколінь кліток подолали 70-75 циклів ділення.

Репарація і захворювання людини як результат порушення репарації. Для збереження основних характеристик кліток і організмів даної популяції необхідне точне збереження структури і стабільності функції генетичного матеріалу впродовж тисяч і мільйонів років, не дивлячись на дію різних мутагенних чинників. Існує декілька причин високої стабільності структури і функцій ДНК. По-перше, це висока хімічна стабільність самої молекули ДНК, а по-друге, це наявність спеціальних механізмів репарації виникаючих змін. Широкий набір різних ферментів реплікацій здійснює безперервний «огляд» ДНК і видалення з неї пошкоджених нуклеотидов. Здібність кліток до виправлення пошкоджень в молекулах ДНК отримала назву репарації (лат.: reparatio — відновлення). Спадкова інформація представлена в ДНК у вигляді ланцюгів подвійної спіралі ДНК. Завдяки цьому випадкове пошкодження в одному з ланцюгів може бути виправлене ферментом реплікації, і дана ділянка ланцюга відновлена в своєму нормальному вигляді за рахунок інформації, що міститься в непошкодженому ланцюзі.

Класифікація репарацій. За часом здійснення в клітинному циклі розрізняють дорепликативную, репликативную і пострепликативную репарацію.

Дореплікатівная репарація. Це процес відновлення пошкодженої нитки ДНК до її подвоєння. У простих випадках розриви можуть возз'єднувати ферментом лигазой. У інших випадках використовується повна ферментативная система эксцизионной або неэксцизионной репарації.

Реплікатівная репарація. Це сукупність процесів відновлення ДНК в ході реплікації. При цьому пошкоджена ділянка віддаляється в ході реплікації в зоні зростання ланцюга. У забезпеченні високої точності реплікації велика роль належить механізму самокоррекции, здійснюваному ДНК-полимеразой або тісно пов'язаною з нею ферментом эндонуклеазой. Цей процес пов'язаний з визначенням помилково включеного в ланцюг нуклеотида, відщеплюванням його і заміною на відповідний. В результаті цього частота помилок знижується в10 разів (з 10-5до 10-6).

Постреплікатівная репарація. Її механізм точно не вивчений. При пострепликативной репарації відбувається вирізування пошкодженої ділянки, що змінює ген. При цьому клітка може зберігати життєздатність і передавати дефектну ДНК дочерним кліткам. Припускають можливість наявності різних варіантів синтезу ДНК на пошкодженій матриці.

По механізмах здійснення репарація підрозділяється на: неэксцизионную репарацію і эксцизионную (що вирізує) репарацію.

Неексцизіонная репарація. Фоторепарація. В результаті ультрафіолетового опромінювання цілісність молекул ДНК порушується, оскільки в них виникають димеры, тобто зчеплені між собою сусідні пиримидиновые підстави. Дімери можуть формуватися між двома тиминами, тимином і цитозином, двома цитозинами, тимином і урацилом, двома урацилами. Проте, опромінені клітки, на світлу виживають набагато краще, ніж в темноті. Після ретельного аналізу причин цього явища, встановлено, що в пошкоджених клітках на світлу відбувається репарація ДНК (фоторепарація). Вона здійснюється спеціальним ферментом ДНК-ФОТОЛІГАЗОЙ, що активується квантами видимого світла. Фермент з'єднується з пошкодженою ДНК, роз'єднує виниклі в димерах зв'язки і відновлює цілісність нитки ДНК. Фермент ДНК-ФОТОЛІГАЗА, що фотоактивується, немає видоспецифичным, тобто діє на різні види ДНК. Як кофермента в нім є цианокобаламин (витий. В|2), що поглинає кванти видимого світла і що передає енергію молекулі ферменту. При неэксцизионной світлової репарації виправляються пошкодження, що виникли тільки під впливом ультрафіолетових променів. На ранніх стадіях еволюції живих організмів, коли був відсутній озоновий екран, що затримує велику частину потоку згубних для організмів сонячних ультрафіолетових променів, фоторепарація грала особливо важливу роль.

Деалкилірованіє гуанинов. Якщо структура ДНК змінена в результаті приєднання до гуанину метилових або етилових груп, то репарацію здійснює фермент гуанин-алкилтрансфераза. Цей фермент відокремлює вказані групи і приєднує їх до себе, після чого структура пошкодженої ділянки ДНК відновлюється.

При эксцизионной (що вирізує) репарації усуваються пошкодження, що з'явилися під впливом іонізуючої радіації, хімічних речовин і інших чинників. Це основний тип репарації, який виявлений як у прокариот, так і в клітках эукариот (рис.11). Механізм эксцизионной репарації ДНК відрізняється тим, що не тільки розрізають димеры (як при світловій), але і вирізуються великі ділянки молекули ДНК (до декількох сотень нуклеотидов). Мабуть можуть віддалятися цілі гени, після чого відбувається репаративный комплементарний матричний синтез за допомогою ферменту ДНК-полимеразы.

Следствія порушення процесу репарації. До теперішнього часу виявлено декілька важких природжених захворювань із-за порушення процесу репарації.

Захворювання у людини, які викликаються генетичними порушеннями системи эксцизионной репарації: 1) пігментна ксеродерма, 2) синдром Кокейна, 3)трихотиодистрофия і 4) синдром передчасного старіння.

Пігментна ксеродерма, захворювання, причиною якого є рецесивна аутосомная мутація, що рідко зустрічається, унаслідок чого у таких дітей

 

 

 

Ріс.11. Схема эксцизионной репарації ДНК по видаленню Т-Т димера: А. Под дією УФ-ОБЛУЧЕНІЯ в ланцюзі ДНК може виникнути мутація (димер Т-Т). В. Соответствуюшая эндонуклеаза дізнається порушення і вирізує ділянку пошкодженого ланцюга ДНК. С. Удаленіє з пошкодженого ланцюга обширної ділянки (що включає димер) ДНК-полимеразой, экзонуклеазной активністю, що володіє. D. Матричний синтез вирізаної ділянки ланцюга за допомогою ДНК-полимеразы і з'єднання його з непошкодженою ділянкою. 1 - эндонуклеаза; 2 - ДНК-полимераза.

 

відсутній один з ферментів репарації ДНК. Шкіра хворих пігментної ксеродермой володіє підвищеною чутливістю до денного світла, що виявляється у вигляді фотодерматозів, включаючи рак шкіри. У ряді випадків відмічені аномалії нервової системи, причиною яких є мутації в одному з семи генів. Проте описані хворі з класичними симптомами пігментної ксеродермы, але з непорушеною системою NER. Для кліток цих хворих характерні зміни в так званій пострепликативной репарації.

Хворим з синдромом Кокейна властиві порушення зростання, розумова відсталість, катаракти, підвищена чутливість до світла з супутніми дерматозами. Виявлені мутації в двох групах генів, що приводять до цього захворювання.

У хворих трихотиодистрофией виявляються змішані симптоми двох перших захворювань.

Синдром передчасного старіння виникає, як і пігментна ксеродермия, при порушенні репараційної системи, яка усуває димеры тимина, що утворюються при УФ-ОБЛУЧЕНІЇ.

Даний синдром підтверджує припущення про те, що і нормальне старіння пов'язане з ослабленням діяльності систем репарації ДНК, так само як і інших захисних систем.

На внутріклітинному рівні існують такі захисні системи: репарація ДНК; теломеры і теломераза; антиоксидантная система (що знешкоджує вільних радикалів); система шаперонов (білків теплового шоку), поновлююча третинну структуру білків при її порушенні унаслідок, наприклад, локального сплеску температури; метилирование ДНК.

Генетична рекомбінація. У эукариот рекомбінацію у вузькому сенсі слова називають кросинговером, тобто рекомбінацією генів, локалізованих в гомологичных хромосомах.

У профазе I мейоза на стадії диплотены у багатьох організмів добре помітні характерні фігури, що утворюються гомологичными хромосомами, - хиазмы. Ще в 1909 р. Ф. Янсенс припустив, що утворення хиазм пов'язане з обмінами гомологичными ділянками гомологичных хромосом. Пізніше Т. Морган пов'язував хиазмы з кросинговером. У 1931г. Харріст Крейтон і Барбара Мак-клінток вирішили цю проблему для кукурудзи, а Курт Штерн - для дрозофилы. Вони показали, що в основі кросинговера лежить реальний обмін ділянками гомологичных хромосом за типом розрив-злиття. Поряд учених (До. Бріджес, І. Андерсон, 1925г. - на дрозофиле; Дж. Тейлор, 1967г. - на конику і ін.) було доведено, що кросинговер відбувається в профазе мейоза на стадії 4 ниток. В результаті цього утворюються хиазмы, які найзручніше спостерігати на стадіях диплотены і диакинеза.

Тип кросинговера в эукариот:

1. Рівний – «звичайний», на якому базується хромосомна теорія Моргана.

2. Нерівний - відбувається рідко, при нерівній кон'югації. При цьому в одній хромосомі опиняються два однакові гени (дупликация), а в іншій – жодного з пари (делеция).

Мітотічеський кросинговер був виявлений в 1936г. К. Штерном у дрозофилы при дослідженні забарвлення тіла і щетин. Його частота на 2-3 порядки менше мейотического.

Чинники, що впливають на кросинговер:

I) випромінювання (УФЛ, рентген-лучи, г-промені);

2) багато хімічних агентів;

3) збільшення і зменшення температури;

4) вік і ін.

Частота кросинговера знаходиться під строгим генетичним контролем. Було показано, що кросинговер не відбувається у самців D.melanogaster, а також у самок тутового шовкопряда.

Кросинговер — це процес обміну відповідними ділянками ДНК між несестринськими хроматидами гомологичных хромосом. При цьому відбувається обмін аллельными генами, що утворює їх нові комбінації в гомологичных хромосомах. Цей процес забезпечує перекомбинацию батьківських і материнських аллелей в групах зчеплення. Розбіжність гомологичных хромосом в різні клітки приводить до утворення різних по аллельному складу гамет. Випадкове розташування хромосом в площині клітки і подальше їх розбіжність в анафазе 1 забезпечує рекомбінацію батьківських груп зчеплення в гаплоидном наборі гамет. Кожна гамета є унікальною відносно аллельного складу. Разним аллельным складом гамет пояснюється те, що нащадки ніколи повністю не схожі один на одного або батьків. Хромосоми, що утворилися в результаті взаємообміну сегментами, відомі як рекомбинантные хромосоми, а хромосоми, интактными, що залишилися, називаються нерекомбинантными.

Молекулярний механізм кросинговера. У цьому процесі беруть участь дві молекули ДНК несестринських хроматид.

 

 

 

Ріс.12. Схема обміну одноцепочного між ДНК несестринських хроматид

 

Суть молекулярного процесу зводиться: а) до розриву двох довгих лінійних молекул ДНК в одній або декількох частинах; би) з'єднанню розірваних ланцюгів молекул ДНК сусідніх хроматид в іншому порядку; у) обміну нуклеотидными послідовностями; г) подальшому розриву і відновленню цілісності ланцюгів молекул ДНК. Процес завершується розбіжністю хромосом. В результаті — ланцюги контактуючих молекул ДНК мають змінений склад нуклеотидов.

У процесі беруть участь десятки різноманітних ферментів. Кросинговер як механізм рекомбінації ефективний тільки у тому випадку, коли відповідні гени гомологичных хромосом представлені різними аллелями. Однакові групи зчеплення не дають нових поєднань.

Типи кросинговера. Залежно від кількості хиазм, що з'явилися, можуть бути розглянуті наступні типи кросинговера:

одиночний кросинговер. В цьому випадку утворюється тільки одна хиазма, що веде до обміну тільки одним ділянкою ДНК гомологичных хромосом. Це найбільш поширений тип кросинговера (рис.12);

подвійний кросинговер. В цьому випадку утворюються дві хиазмы. Вони можуть з'являтися як між одними і тими ж несестринськими хроматидами, так і між разными несестринськими хроматидами. Цей тип кросинговера приводить до обміну двома ділянками ДНК гомологичных хромосом;

множинний кросинговер. В цьому випадку утворюється більше двох хиазм (перекрестов) між несестринськими хроматидами гомологичных хромосом. Далі вони можуть бути класифіковані як потрійні (3 хиазмы), четвертні (4 хиазмы) і так далі

Значення кросинговера. Кросинговер — широко поширене явище. Він відбувається практично у всіх організмів, що розмножуються статевим шляхом. Цей процес є молекулярною основою комбинативной мінливості. В результаті рекомбінації генів можуть з'являтися нові корисні ознаки і їх поєднання. Тому кросинговер має велике значення для виживання і розмноження. Цей процес також збільшує генетичну різноманітність потомства, що дуже важливе для пристосування і еволюції. Визначення частоти кросинговера лежить в основі картирования генів хромосом, тобто визначення місця розташування різних генів в хромосомі.

Форми обміну генетичним матеріалом у бактерій. Прокаріоти (бактерії, ціанобактерії) - гаплоидные організми. Для них немає поняття доминантность- рецесивність, вони не мають ні митоза, ні мейоза. З 1944г. по 1952г. у бактерій були розшифровані процеси, що приводять до об'єднання і рекомбінації генетичного матеріалу.

Крім основного механізму передачі генів — по спадку (по вертикалі), у бактерій існують наступні форми обміну генетичним матеріалом по горизонталі, тобто між окремими особинами в популяції кліток: трансформація, трансфекция, трансдукция, кон'югація і сексдукция.

Трансформація — перенесення генетичного матеріалу, що полягає в тому, що бактерія-реципієнт захоплює (поглинає) із зовнішнього середовища фрагменти чужорідної ДНК. Трансформація може бути спонтанною або індукованою. Індукована (штучно отримувана) трансформація відбувається при додаванні до культури бактерій очищеної ДНК, отриманої з культур тих бактерій, генетичні ознаки яких прагнуть передати досліджуваній культурі. Спонтанна трансформація відбувається в природних умовах і виявляється у виникненні рекомбинантов при змішуванні кліток, що генетично розрізняються. Вона протікає за рахунок ДНК, що виділяється клітками в навколишнє середовище унаслідок їх лізису або в результаті активного виділення ДНК життєздатними клітками-донорами. Як спонтанна, так і індукована трансформація зводиться, по суті, до поглинання трансформуючої ДНК і утворення рекомбинантов, причому спонтанна трансформація може відбуватися в результаті взаємного обміну ДНК. Ефективність індукованої трансформації багато в чому залежить від фізіологічного стану кліток-реципієнтів. Вони повинні знаходитися в стані своєрідної компетентності для цього процесу. Передбачається, що у фазі компетентності відбуваються значні зміни поверхневих шарів клітки, які сприяють поглинанню ДНК. Зокрема, аутолитические ферменти клітки розчиняють клітинну стінку в тих ділянках, де відбувається її синтез. При цьому мезосомы через отвори, що утворилися, стикаються із зовнішнім середовищем, адсорбують і втягують всередину клітки трансформуючу ДНК, де вона і вступає в рекомбінацію з ДНК реципієнта. В результаті цього утворюється мерозигота, клітина ділиться, і її нащадки успадковують ознаки, отримані від донора і реципієнта.

Проте в інших випадках поглинені фрагменти ДНК руйнуються нуклеазами клітки-реципієнта, і трансформації не відбувається. Її ефективність залежить також від розмірів трансформуючої ДНК: високомолекулярна ДНК поглинається важче, ніж менш крупні її фрагменти. Здібність до трансформації виявлена у ряду пологів бактерій, але, мабуть, роль її в обміні генетичним матеріалом серед бактерій в природних умовах менш істотна, чим роль інших механізмів. Річ у тому, що у багатьох бактерій є особливі системи рестрикції і модифікації. Ці системи модифікують свою ДНК (найчастіше шляхом її метилирования) і руйнують чужорідну ДНК, якщо вона так само не модифікована, за допомогою особливих ферментів — рестрикционных эндонуклеаз.

Ефективність методу генетичної трансформації у багато разів підвищується в тому випадку, якщо суміш ДНК і трансформованих кліток за допомогою спеціального приладу піддати обробці електричним імпульсом. Метод електротрансформації є універсальним, він застосовний до будь-яких видів бактерій. За допомогою цього методу здійснена трансформація більше 100 видів бактерій, і він може стати важливим інструментом отримання цінних рекомбинантных штамів бактерій.

Трансфекция — варіант трансформації бактерійних кліток, позбавлених клітинної стінки, здійснюваний вірусною (фаговой) нуклеїновою кислотою. За допомогою трансфекции вдається викликати у таких бактерій (без клітинної стінки) вірусну інфекцію. Трансфекцию можна здійснити і з іншими (не бактерійними) клітками, якщо ввести в них чужорідну ДНК, здатну рекомбинировать з ДНК цих кліток, або здатну відтворювати віріони, або самостійно реплицироваться.

Трансдукция — перенесення генетичного матеріалу від клітки-донора клітці-реципієнтові за допомогою бактеріофагів. Розрізняють трансдукцию неспецифічну і специфічну. Неспецифічна трансдукция — випадкове перенесення фрагментів ДНК від однієї бактерійної клітки до іншої.

Специфічна трансдукция здійснюється тільки помірними фагами, що володіють здатністю включатися в строго певні ділянки хромосоми бактерійної клітки і трансдуцировать певні гени.

Кон'югація - процес обміну генетичним матеріалом (хромосомним і плазмидным), здійснюваний при безпосередньому контакті кліток донора і реципієнта. Цей процес контролюється тільки конъюгативными плазмидами, що мають сукупність генів, звану tra-опероном (tra — від англ. transfer — перенесення). Цей оперон контролює синтез апарату перенесення, конъюгативную реплікацію і явище поверхневого виключення. Апаратом перенесення є спеціальні донорные ворсинки, за допомогою яких встановлюється контакт між конъюгирующими клітками. Донорниє ворсинками є довгі (1-20мкм) тонкі трубчасті структури білкової природи з діаметром внутрішнього отвору близько 3 нм. Число донорных пилей у кожної F+-клетки невелике і, очевидно, відповідає числу копій конъюгативной плазмиды в клітці. Донорниє ворсинки виявляють за допомогою донорспецифических фагов, які, адсорбуючись на них, проникають в клітку і викликають її лізис. Для кожної групи конъюгативных плазмид існують свої донор специфічні фаги. Ворсинки виконують наступні функції: 1) з їх допомогою встановлюється контакт між донорной і реципиентной клітками; 2) вони полегшують перенесення нитки ДНК (вона, ймовірно, протягається через ворсинку); 3) стягують клітки, що злучаються, що підвищує ефективність кон'югації.

Процес кон'югації протікає через наступні стадії: встановлення контакту між донором і реципієнтом, протягання нитки ДНК від донора до реципієнта, добудова перенесеної нитки ДНК комплементарною нею ниткою в реципиентной клітці і рекомбінація між переданою хромосомою (її фрагментами) і хромосомою клітки-реципієнта (рис.13), розмноження мерозиготы і утворення кліток, що несуть ознаки донора і реципієнта.

 

 

Ріс.13. Схема рекомбінації у бактерій

 

Суть поверхневого виключення полягає в тому, що під контролем tra-генов синтезуються білки зовнішньої мембрани, що перешкоджають (що виключають можливість) проникненню в клітку, що несе плазмиду, інший, але близькоспорідненої нею плазмиды, або що пригнічують конъюгативную реплікацію її ДНК.

Кон'югатівная реплікація переносимої нитки хромосомної або плазмидной ДНК здійснюється також під контролем плазмидных генів. Класичним прикладом конъюгативной плазмиды є статевий чинник, або F-плазмида (F — від англ. fertility — плодючість). Ця плазмида є двунитевую кільцеподібну молекулу ДНК, що складається з 94,5 тисяч п. н. Головна функція цієї плазмиды — контроль кон'югації у бактерій кишкової групи. Її tra-оперон містить більше тридцяти генів, які контролюють процес кон'югації. Ця плазмида може знаходитися як в автономному стані, так і інтегруватися в хромосому клітки. Знаходячись в автономному стані, вона контролює тільки власне перенесення, при якому FЕ-клетка (клітка, позбавлена F-плазмиды) перетворюється на F+-клетку (клітку, що містить F-плазмиду), F-плазмида може інтегруватися в певні ділянки бактерійної хромосоми, в цьому випадку вона почне контролювати конъюгативный перенесення хромосоми клітки. При цьому одна з ниток ДНК хромосоми в місці інтеграції F-плазмиды розрізає, і її 5'-конец через донорный місток починає протягуватися в клітку-реципієнта. Реплікація ДНК в цьому випадку протікає за принципом кільця, що «крутиться». Таким чином, кон'югація починається зі встановлення контакту між донором і реципієнтом за допомогою донорной ворсинки. Остання змикається з рецептором клітинної мембрани клітки-реципієнта.

Нерідко такий контакт встановлюється не тільки між двома клітками, а між багатьма клітками, утворюючи агрегати спаровування. Припускають, що нитка ДНК в процесі кон'югації протягається через канал донорной ворсинки. Оскільки донорный місток є неміцним, процес кон'югації може у будь-який момент урватися. Тому при кон'югації може переноситися або частина хромосоми, або рідше, повна хромосома. За допомогою F-плазмид частота перенесення генів між бактеріями істотно зростає. Тому клітки, у яких F-плазмида итегрирована в хромосому, позначають як клітки Нfг (Нfг — від англ. high frequency recombination — клітки, що забезпечують високу частоту рекомбінацій).

В деяких випадках інтегрована в хромосому F-плазмида може з неї виключатися і, подібно до помірного фагу, «вихоплювати» з хромосоми її ген або навіть цілу групу генів. Така плазмида, що містить в своїй ДНК частину генів хромосоми клітки, називається FЕ-плазмидой.

Сексдукция — перенесення генетичного матеріалу між бактерійними клітками, здійснюване FЕ-плазмидой за допомогою механізму, аналогічного специфічною трансдукции.

Завершальним етапом при будь-якій формі обміну генетичним матеріалом є рекомбінація між привнесеною ДНК і хромосомою клітки-реципієнта. Якщо переноситься одна нитка ДНК, то вона спочатку добудовується комплементарною нею ниткою; рекомбинируют між собою тільки двунитевые ДНК. Розрізняють загальну рекомбінацію, сайт-специфическую рекомбінацію і рекомбінацію, контрольовану елементами, що транспонуються. Загальна рекомбінація відбувається між гомологичными ДНК. Сайт-специфічеськая рекомбінація відбувається за рахунок наявності специфічних ділянок у рекомбинируемых молекул ДНК. Її прикладом є специфічна рекомбінація між помірним фагом л і хромосомою Е.соli. Як у бактерійній хромосомі, так і в ДНК фага л є специфічні ділянки (аttВ і аttP відповідно), між якими і відбувається сайт-специфическая рекомбінація. Загальна і сайт-специфическая рекомбінації контролюються геном rесА.

Рекомбінації, здійснювані елементами, що транспонуються, теж є сайт-специфическими, але специфічність цих сайтів пов'язана з особливими нуклеотидными послідовностями, і ця форма рекомбінації не залежить від rесА-гена.

Головним генетичним детермінантом всіх шляхів рекомбінації є ген rесА. Його пошкодження повністю виключає можливість утворення рекомбинантов. Основний шлях rесА-рекомбинации здійснюється за участю продуктів генів rесВ і rесС (вони кодують синтез эндонуклеазы V).

У разі мутації по rесВ і rесС виходу рекомбинантов складає близько 20% від rеc+. Проте ці мутації можуть бути виправлені шляхом механізмів супрессии в двох генах: sbсАЕ і sbсВЕ. Супрессиі sbсАЕ відкривають додатковий шлях рекомбінації через ген rесЕ (його продукт — экзонуклеаза VIII). Супрессиі sbсВЕ реалізують рекомбінації через ген rесЕ (структурний ген экзонуклеазы I). Таким чином, генетичний контроль рекомбінацій носить складний характер.

Вивчення його механізму — одне з центральних завдань молекулярної генетики. Особливий інтерес представляє вивчення механізму гомологической рекомбінації. Це визначається перспективами розвитку молекулярної медицини. Одному з найважливіших стратегічних завдань, поставлених перед програмою «Геном людини», є виявлення змін первинної структури ДНК, яка приводить до порушення функції генів і, як наслідок цього, до розвитку спадкових захворювань людини. Ідеальним методом лікування їх є генотерапия, заснована на заміні пошкодженого («хворого») гена здоровим в місці його локалізації на хромосомі. Така заміна може бути здійснена тільки за допомогою гомологической рекомбінації, механізми якої у бактерій і эукариот, очевидно, багато в чому схожі. У бактерій виявлено два способи такої рекомбінації, здійснюваних двома типами рекомбиназ: АТФ-зависимым білком RесА і не-залежною ренатуразой. Відповідно, і у эукариот виявлена АТФ-зависимые і не-залежна ДНК-трансферазы, серед якої знайдені білки, функціонально схожі з RесА-белком бактерій.