Определение протеина С иммунохимическим методом

Иммунохимическое определение протеина С применяется реже, чем функциональные методы. Это объясняется тем, что данный способ выявля­ет только классическое снижение концентрации протеина С и не определяет его функциональную неполноценность. Методическим обеспечением этого определения чаще всего служат автомати­зированный турбидиметрический метод или ELISA-тест.

Оценка результатов

В норме активность протеина С у взрослых составляет 70-140%.

Небольшое повышение протеина С отмеча­ется во время беременности, а уменьшение - в пос­леродовом и послеоперационном периодах.

Снижение содержания (активности) протеи­на С наблюдается при:

• врожденном (наследственном) дефиците или
аномалиях протеина С;

• геморрагической болезни новорожденных;

• заболеваниях печени с нарушением функции;

• синдроме острой дыхательной недостаточно­
сти;

• менингококковом сепсисе;

• ДВС-синдроме;

• гемодиализе;

 

 

 

• лечении L-аспарагиназой;

• лечении пероральными (непрямыми) антико­
агулянтами (дефицит витамина К).
Отдельные результаты могут колебаться в

зависимости от используемых методов и тест-на­боров, тем более что многие из них разработаны до того, как стала известна мутация гена факто­ра V Лейден. В общем случае разведение пробы может минимизировать влияние фактора V Лей­ден в коагуляционных тестах.

В некоторых случаях при лечении больных с дефицитом протеина С непрямыми антикоагулян­тами у них могут возникнуть некрозы кожи в ре­зультате рикошетных тромбозов. Если антикоагу­лянты назначаются в высокой дозе без поддержки гепарином, то возникает состояние, при котором протеин С очень быстро снижается (время его по­лужизни в системе циркуляции 4-6 ч). В то же вре­мя витамин-К-зависимые факторы свертывания, в том числе протромбин, остаются еще в пределах нормы (у них период полужизни 16-20 ч) (рис. 116).

Рис. 116. Быстрое снижение протеина С, превышающее уменьшение витамин-К-зависимых факторов свертывания, может быть причиной возникновения тромботического со­стояния (рикошетные тромбозы) при начале лечения высо­кими дозами непрямых антикоагулянтов

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

 

Эта ситуация может усугубляться тем, что непря­мые антикоагулянты начинают назначать в слу­чае развития тромбозов или угрожающей ситуа­ции по тромбообразованию (при воспалении, ин­фекциях, лихорадке), когда система прокоагулян-тов активирована. Быстрое снижение протеина С провоцирует в этом случае массивное тромбооб-разование, проявляющееся вплоть до некрозов кожи. Непосредственно в период лечения непря­мыми антикоагулянтами (кумаринами) определе­ние протеина С затруднено. Определять его сле­дует до начала лечения кумаринами.

Определение протеина S

Протеин S - витамин-К-зависимый белок, который является кофактором АПС. Эта функ­ция положена в основу всех известных коммер­ческих тест-систем определения протеина S. Опи­саны случаи как функционального, так и количе­ственного дефицита протеина S. При проведении тестов важно помнить, что протеин S присутству­ет в плазме частично в свободном состоянии, ча­стично в комплексе с С4-связывающим протеи­ном (С4-СП), но активна только свободная фор­ма протеина S.

Определение протеина S коагуляционным ме­тодом

Для определения протеина S необходимо использовать тест-систему, содержащую очищен­ный активный протеин С, его субстрат - фактор Va и дефицитную по протеину S плазму. После ин­кубации исследуемой плазмы с тест-системой определяют время свертывания, выполняя тест АЧТВ или индуцируя активацию змеиным ядом, фосфолипидами и Са²⁺ (рис. 117). Удлинение вре­мени свертывания пропорционально активности протеина S. Специфичность метода относитель­ная, так как фактор V Лейден, высокий уровень

ф.VIII и волчаночный антикоагулянт могут су­щественно влиять на результаты теста, а именно: с этими факторами часто проводят дифференци­альную диагностику, определяя протеин S. На результаты влияют качество дефицитной плазмы и препаратов АПС, а также состав фосфолипи-дов, поэтому значения теста зависят от конкрет­ного производителя. Так как коагуляционный метод подвержен действию многих интерфериру­ющих факторов и не стандартизован, то предпо­читают использовать иммунохимический метод для определения протеина S.

Определение протеина S иммунохимическим методом

Иммунохимический метод достаточно широ­ко распространен. Первая генерация тест-набо­ров определяла «общий протеин S», включая сво­бодную форму и форму протеина S, связанную с белком С4-СП. Наборы последних генераций позволяют определять «свободный протеин S» прямо без предварительной обработки. Чаще все­го используют турбидиметрический метод с по­листироловыми частицами или метод ELISA. Недостатком иммунохимического метода являет­ся то, что он выявляет протеолитически неактив­ные формы протеина S, которые иногда появля­ются в плазме.

Оценка результатов

Уменьшение содержания (активности) проте­ина S наблюдается при:

• врожденном (наследственном) дефиците;

• врожденном (наследственном) уменьшении
свободной фракции протеина S;

• заболеваниях печени с нарушением синтети­
ческой функции;

• нефротическом синдроме;

• ДВС-синдроме;

Рис. 117. Принцип определения протеина S коагуляционным методом

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

• системной красной волчанке;

• лечении L-аспарагиназой;

• лечении пероральными (непрямыми) антико­
агулянтами;

• приеме эстрогенов (пероральных контрацеп­
тивов);

• беременности, в послеродовом периоде;

• наличии аутоантител к протеину S.
Относительный дефицит протеина S наблю­
дается при повышении С4-СП. С4-СП - белок
острой фазы, его количество повышается в
плазме крови при воспалении, аутоиммунных
реакциях, беременности, у женщин, принима­
ющих стероидные контрацептивы. С4-СП оп­
ределяют методом иммунотурбидиметрии или
ELISA.

Определение антитромбина

В клинико-диагностических лабораториях AT определяют иммунохимическими методами (ELISA, турбидиметрия, нефелометрия), тестами с хромогенными субстратами или коагуляцион-ными методами.

Методом с хромогенным субстратом AT оп­ределяется через фактор Ха или Па при насы­щающей концентрации гепарина. Принцип оп­ределения AT представлен на рис. 118. При вы­боре предпочтение отдают методу с использо­ванием ф.Ха, так как он более стабилен и под­вержен меньшим влияниям со стороны интер­ферирующих воздействий, чем тромбин (фак­тор На).

Нормальный уровень активности AT в плаз­ме взрослых колеблется в диапазоне 75-125%, этот диапазон практически одинаков при исполь­зовании разных тест-наборов. Дефицит AT - се­рьезный фактор риска развития венозных тром­бозов.

У новорожденных уровень AT составляет около 50% и достигает уровня взрослых к 6 мес.

Небольшое снижение AT наблюдается в середи­не менструального цикла, в пред- и послеродо­вом периоде, при токсикозах второй половины беременности, в послеоперационном периоде. Эти сдвиги более выражены у пациентов с груп­пой крови А (II), а также у пожилых.

Снижение содержания (активности) А Т от­мечается при:

• врожденном (наследственном) дефиците или
аномалии AT (снижение активности или чув­
ствительности к гепарину);

• заболеваниях печени (опухоли, цирроз, алко­
гольный гепатит);

• нефротическом синдроме (протеинурия свы­
ше 5 г/л);

• карциноме легких;

• ДВС-синдроме;

• множественных травмах, тяжелых родах, по­
здних гестозах;

• приеме эстрогенов (пероральных контрацеп­
тивов), кортикостероидов;

• лечении L-аспарагиназой;

• многие протеазы, включая гранулоцитарную
эластазу, могут вызывать деградацию AT.
Тест может применяться для мониторинга

лечения гепарином. Длительная гепаринотера-пия может приводить к снижению активности AT в плазме. Лечение высокими дозами гепари­на, особенно нефракционированным гепарином, приводит к транзиторному снижению AT по ме­ханизму потребления (рис. 119), особенно у боль­ных с тяжелой патологией, в критических слу­чаях, при ДВС-синдроме, сепсисе, злокачествен­ных опухолях.

Увеличение содержания (активности) А Т от­мечается во время менструации, а также при:

• остром вирусном гепатите;

• холестазе;

• приеме анаболических стероидов;

• лечении пероральными (непрямыми) антико­
агулянтами.

 

Рис. 118. Принцип определения антитромбина (AT) хромогенным методом

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

 

Рис. 119. Снижение уровня AT в плазме в период активно­го лечения нефракционированным гепарином