Определение протромбина (фактора II) с использованием хромогенного субстрата

. -■ --■ --------......

Протромбин достаточно надежно определя­ется коагуляционным методом. Однако опреде­ление протромбина с использованием хромоген­ного субстрата относительно хорошо стандарти­зовано. Кроме того, измерительный диапазон существенно расширяется при скрининге пациен­тов с протромбиновой мутацией G20210A, при которой увеличен риск тромбоэмболии. Про­тромбин активируется металлопротеазой экари-ном (фермент яда эфы многочешуйчатой) до ме-зотромбина - производное, которое не блокиру­ется гепарином и комплексом антитромбин-гепа­рин, но способно гидролизовать хромогенный субстрат (рис. 107) и свертывать не только обык­новенный фибриноген, но и некоторые тромбин-резистентные его производные (РКМФ).

PIVKA-протромбин активируется экарином, поэтому этот хромогенный тест может дать ложно-

завышенные результаты по активности протромби­на у пациентов, принимающих непрямые антикоа­гулянты или страдающих дефицитом витамина К. Примечание. PIVKA - Proteins Induced by Vita­min К Absence or Antagonists - протеины, синте­зируемые печенью при отсутствии витамина К или в присутствии его антагонистов (непрямых анти­коагулянтов). PIVKA не способны участвовать в процессе свертывания крови (см. раздел «Лечение антикоагулянтами непрямого действия».

Рис. 107. Принцип определения протромбина с исполь­зованием хромогенного субстрата

 

Определение фактора XIII

Исследование фактора XIII следует проводить в тех случаях, когда у больного имеются проявле­ния кровоточивости, но при этом ПВ, АЧТВ и тес­ты на первичный гемостаз нормальные. Среди ори­ентировочных и скрининговых тестов на недоста­точность ф.ХIII может указать только тромбоэлас-тограмма, на другие тесты дефицит ф.ХIII практи­чески не влияет. В то же время дефицит ф.ХIII име­ет выраженные клинические проявления и может быть причиной кровотечений неясной этиологии у человека на фоне полного здоровья, геморрагичес­кого синдрома при ДВС, гиперфибринолизе, после

удаления миндалин, при патологии печени и кост-но-мозгового кроветворения. Дефицит ф.ХIII мо­жет быть врожденным и приобретенным, в том чис­ле в результате появления аутоантител. Определе­ние дефицита ф.ХIII и его причины необходимо для назначения адекватного лечения, в частности ис­пользования концентратов фактора XIII. Для оп­ределения врожденного дефицита ф.ХIII использу­ются иммунохимические методы, в том числе ELISA, применяется ПЦР-диагностика для геноти-пирования врожденных мутаций. Однако ф.ХIII -это высокополиморфный белок, определение его

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

структурных компонентов часто бывает недоста­точным, поэтому требуются функциональные тес­ты с определением активности ф.ХIII.

Фотометрический метод

Фактор XIII - фермент трансглютаминаза, которая образует поперечные сшивки между пеп­тидами. При этом изопептидные связи образуют­ся между остатками глютамина и лизина, в реак­ции освобождается аммиак. Последний опреде­ляется в ферментной реакции с глютаматдегид-рогеназой (ГлДГ) и α-кетоглютаратом, кофакто­ром реакции является НАДН, окисляющийся до НАД (рис. 108). Измерение проводится фотомет­рически при длине 340 нм, метод может выпол­няться на биохимических анализаторах.

Инкорпорирующий метод

Разработан новый метод определения фак­тора XIII, основанный на введении субстрата в

иммобилизированный белок, которое обеспечи­вается фактором ХIIIа. Раньше иммобилизо­вался казеин. В новом методе используется физиологический субстрат-фибрин. Фактор ХIIIа инкорпорирует субстрат 5-(биотинамидо)-пен-тиламин (БАПА) в фибрин, который определя­ется количественно с конъюгатом стрептави-дин-щелочная фосфатаза (рис. 109). Инкорпо­рирующий метод позволяет оценивать физиоло­гическую роль мутации Val34Leu фактора XIII, которая сочетается с риском внутричерепных кровоизлияний и кровотечений из внутренних органов. В то же время больные с этой мутаци­ей фактора XIII практически не страдают ин­фарктом миокарда и венозными тромбозами. Мутацию Val34Leu фактора XIII не выявляет фотометрический метод. Инкорпорирующий метод может с успехом использоваться для мо-ниторирования больных с очень низким уров­нем ф.ХIII, что бывает при наследственных де­фицитах.

 

 

Рис. 108. Принцип определения фактора XIII фотометрическим методом

 

Рис. 109. Принцип определения фактора XIII инкорпорирующим методом. БАПА - 5-(биотинамидо)-пентиламин, ЩФ-щелочная фосфатаза

 

 

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Тесты для определения гепарина

Антикоагулянты прямого действия широко используются для профилактики и лечения тром-боэмболической болезни. Традиционный тест АЧТВ полезен для контроля за лечением гепари­ном, когда гепарин применяется в относительно низких концентрациях (описан выше). При вы­соких дозах гепарина, например при операциях на открытом сердце или при диализе, АЧТВ не позволяет следить за эффектами гепарина. Анти-коагулянтное действие низкомолекулярного гепа­рина АЧТВ не улавливает.

Определение гепарина