С помощью хромогенных субстратов

Синтетические субстраты применяются для определения гепарина, особенно при использова­нии низкомолекулярного гепарина (НМГ). Гепа­рин определяется опосредованно: используется его способность усиливать комплексообразование ф.Ха или тромбина с антитромбином и тем самым подавлять активность этих протеаз, после чего оп­ределяется их остаточная активность (рис. 110). Тест с определением остаточной активности ф.Ха («анти-Ха-активность») применяется при контро­ле за лечением короткоцепочечным фракциони­рованным гепарином, который обладает большей тропностью к ф.Ха, чем к тромбину. Кроме того, ф.Ха - относительно стабильный фермент, поэто­му тест с использованием этого фактора техни­чески более надежный, чем тест с активным тром­бином.

Тест может выполняться в разных модифи­кациях: как кинетический метод, определение по начальной скорости или метод по конечной точке. В некоторых тестах используется насы­щающая концентрация AT, тогда тест обозна­чается как «общий гепарин», в других - исполь-

зуется эндогенный AT пробы, в этих случаях тест обозначается как набор для определения комплекса гепарин-АТ, или «активный гепа­рин». Определение гепарина с использованием хромогенных субстратов легко адаптируется для автоматических биохимических анализато­ров. На результаты теста с хромогенными суб­стратами не оказывают влияния продукты дег­радации фибрина (ПДФ) и повышенное содер­жание ф.VIII, которые меняют результаты при определении АЧТВ.

Для тестов на определение гепарина разра­ботаны и промышленно выпускаются калибра­торы - лиофильно высушенные препараты плаз­мы со стандартным содержанием гепарина. Ка­либраторы должны быть тестированы по стан­дарту ВОЗ, которому придано значение актив­ности 1,0 анти-Ха-Ед/мл. Терапевтический диа­пазон для лечения гепарином рекомендуется в пределах 0,3-0,7 анти-Ха-Ед/мл.

Определение гепарина

С помощью коагуляционных методов

Принцип определения гепарина с использо­ванием коагуляционных тестов подобен таково­му в тестах с хромогенными субстратами. Опре­деление основано на ингибировании свободного ф.Ха на первом этапе. После инкубационного периода выпадение сгустка вызывается добавле­нием реактивов, содержащих фосфолипиды с ад­сорбированными на них фактором V, протром­бином, фибриногеном из бычьей плазмы и СаС1₂ (рис. 111). Автоматизация этого метода затруд­нена, так как сигнал достаточно слабый для оп­тического метода. Тест может выполняться на цельной крови на коагулометрах с механической системой регистрации.

Рис. 110. Принцип определения содержания гепарина с использованием хромогенного субстрата, AT - антитромбин

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

 

Рис. 111. Принцип определения содержания гепарина коагуляционным методом

Преаналитические факторы, влияющие на результаты определения гепарина

Качество подготовки пробы - существенный фактор, влияющий на результаты определения гепарина. Нарушение взятия крови из локтевой вены может сопровождаться активацией тромбо­цитов in vitro, что приведет к ложным результа­там с недооценкой содержания гепарина в крови больных. При активации тромбоцитов освобож­дается фактор 4 тромбоцитов (PF4). PF4 высту­пает как естественный антигепарин, нейтрализу-

ющий как нефракционированный, так и низко­молекулярный фракционированный гепарин (НМГ), хотя следует отметить, что НМГ менее чувствителен к подавляющему действию PF4.

Для предупреждения этого эффекта и подав­ления активации тромбоцитов при транспорти­ровке крови рекомендуется использовать специ­альные пробирки для крови, например CTAD tubes, в которых содержится цитрат, теофиллин, аденозин, декстроза - «коктейль», который пре­дупреждает активацию тромбоцитов.

Методы для определения резистентности к активированному протеину С,

 

активности протеина S, антитромбина, антифосфолипидных антител

Резистентность к протеину С

Термин «резистентность к протеину С» вве­ден при описании феномена практического отсут­ствия удлинения АЧТВ после добавления акти­вированного протеина С (рис. 112). Устойчивость (резистентность) ф.Vа к ингибирующему воздей­ствию активированным протеином С (РАПС) -один из серьезных факторов риска патологичес-

Рис. 112. Резистентность к активированному протеи­ну С (АПС) при мутации в гене, контролирующем синтез фактора V, которая приводит к образованию фактора Лейден. Тест основан на определении АЧТВ

ких тромбозов. РАПС - нарушение функциони­рования системы протеина С.

Факторы, которые влияют на РАПС, представ­лены в табл. 26. РАПС может быть как врожден­ной, так и приобретенной. В случае наследования РАПС гетерозиготы имеют риск развития тромбо­зов примерно в 7 раз, а гомозиготы - в 80 раз выше, чем в среднем по популяции. РАПС была обнару­жена среди 20% больных с первичным тромбозом глубоких вен бедра и среди 40% больных тромбо-филией. По разным данным от 20 до 60% больных с тромбозом глубоких вен бедра имеют РАПС.

Таблица 26

Факторы, влияющие на резистентность к АПС

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

Скрининговые тесты на АПС разработаны на основе модифицированного теста АЧТВ, кото­рый проводится с и без АПС, или на основе ПВ со змеиным ядом.

Тест резистентности фактора Va к АПС на основе модифицированного АЧТВ

Добавление АПС в норме вызывает удлине­ние АЧТВ за счет инактивации факторов Va и Villa в плазме. Поэтому в тесте сравнивается вре­мя выпадения сгустка в тесте АЧТВ с добавлени­ем и без добавления АПС и рассчитывается от­ношение (рис. 114). Референтные значения теста зависят от используемых реактивов и приборов. Тем не менее, несмотря на разные методы и при­борную базу, обычно добавление АПС к плазме приводит, по крайней мере, к 2-кратному удли­нению АЧТВ (табл. 27).

Недостаточное удлинение АЧТВ (патологи­ческий результат, свидетельствующий о РАПС) наблюдается у пациентов с фактором V Лейден, волчаночным антикоагулянтом, при беременно­сти, увеличенном содержании фактора VIII и при-

еме оральных контрацептивов. Этот тест имеет специфичность для выявления фактора V Лейден примерно 80%, неполная специфичность связана с влиянием на результат других факторов, в част­ности с подавлением активности фактора VIIIa. На результаты теста оказывают влияние прием не­прямых антикоагулянтов и введение гепарина. Тест полезен для выявления пациентов с высоким риском тромбоэмболической болезни.

Тест для диагностики фактора V Лейден

Мутация гена фактора V (фактор Лейден) оценивается как наиболее распространенная при­чина РАПС. Эту патологию можно выявить при проведении теста на РАПС с плазмой пациента, разбавленной 1:5 плазмой с дефицитом ф.V. Этот тест обладает высокой специфичностью и чув­ствительностью на выявление фактора V Лейден (табл. 28).

Тест на РАПС проводится также с использова­нием змеиного яда, обозначаемого как протак (Рго-tac), специфически активирующего протеин С. При внесении активатора протеина С в смесь нор-

 

Примеры резистентности к активированному протеину С

Таблица 27

 

 

 

Таблица 28

Примеры определения резистентности к активированному протеину С методом без разведения и методом разведения испытуемой плазмы плазмой с дефицитом ф. V

 

 

 

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

 

мальной и дефицитной по ф.V плазмы время свер­тывания в тесте АЧТВ удлиняется примерно в 2 раза. Если имеется РАПС, удлинение АЧТВ вы­ражено в малой степени.

Определение протеина С

Для определения протеина С разработано несколько методов: иммунохимический метод, метод с хромогенным субстратом и коагуляцион-ный вариант. Для функциональных методов ис­пользуется специфический активатор протеина С из яда змеи щитомордника, обозначаемый как протак.

Определение протеина С с использованием хро-могенного субстрата

Рис. 113. Принцип определения протеина Сс использо­ванием хромогенного субстрата, АПС - активированный протеин С

Определение основано на активации протеи­на С активатором протак с последующим опре­делением (кинетическим методом или методом конечной точки) изменения оптической плотнос­ти пробы из-за образования паранитроанилина (рис. 113). Этот метод прост, специфичен, легко автоматизируется. Так как протеин С - витамин-К-зависимый гликопротеин, то при лечении не­прямыми антикоагулянтами (антагонистами ви­тамина К) появляются PIVKA-формы протеина С, которые не обладают антикоагулянтной актив­ностью, но определяются методами с хромоген-ными субстратами. Поэтому у больных, прини­мающих непрямые антикоагулянты, могут быть завышенными результаты определения протеина С хромогенными методами.

разцах исследуемой плазмы активируется про-таком. Для контроля тест проводится с и без протака (рис. 114). Активированный протеин С вызывает протеолиз и соответственно инактива­цию факторов Va и VIIIa в плазме (рис. 115). Последнее сопровождается удлинением времени свертывания в тесте АЧТВ, по которому оцени­вается активность протеина С в плазме пациен­та. Если фактор Va нечувствителен к активному протеину С, то АЧТВ не удлиняется в присут­ствии активатора протеина С. Рассчитывают отношение АЧТВ с протаком/АЧТВ без прота­ка, величина которого определяется в конкрет­ной лаборатории, так как тест зависит от исполь­зованных приборов и реактивов. Тем не менее этот коэффициент близок к 1 практически у всех больных с фактором Лейден и с дефицитом про­теина С и существенно выше 1 в случаях без де­фицита активности протеина С и при дисфунк­ции протеина S. Метод легко автоматизируется.

Коагуляционный метод оценивает актив­ность протеина С, фиксирующегося карбоксили-рованной частью на фосфолипидах. PIVKA-фор­мы не функционируют в этой системе, и тест не дает ложных результатов у пациентов, принима­ющих непрямые антикоагулянты или имеющих дефицит витамина К.

Исказить результаты теста могут такие фак­торы, как наличие мутации ф.V Лейден, присут­ствие в плазме волчаночного антикоагулянта,

 

Определение протеина С коагуляционным ме­тодом

Пробы пациентов сопоставляются с дефи­цитной по протеину С плазмой, которую полу­чают методом иммуносорбции. Протеин С в об-

Рис. 114. Принцип скрининга на резистентность к акти­вированному протеину С (РАПС). Активатор протеина С из змеиного яда (протак), добавленный к пробе, в норме существенно удлиняет АЧТВ, Если же имеет место РАПС, то удлинения АЧТВ в присутствии протака не происходит

Обеспечение диагностики нарушений гемостаза в КДЛ

 

Рис. 115.Принцип определения протеина С коагуляционным методом. АПС - активированный протеин С, ФЛ фосфолипиды

терапия гепарином. Для получения достоверных результатов очень важно качество используемой протеин-С-дефицитной плазмы.

У некоторых пациентов, принимающих не­прямые антикоагулянты, выявляются чрезвычай­но низкие цифры содержания протеина С. Эти результаты могут быть связаны не только с ис­тинным дефицитом протеина С, но и с развитием резистентности фактора Va к АПС.