Более сложные соединения, в состав которых входит система кумарина.

Кумарины широко распространены в растительном мире, особенно среди представителей семейств зонтичных, бобовых, рутовых. В природе чаще всего встречаются наиболее простые производные кумарина и фурокумарина. Основное количество представителей соединений этой группы найдено в свободном состоянии и лишь незначительное число в виде гликозидов.

Кумарины локализуются в различных органах растений, чаще всего в корнях, коре, плодах. Содержание кумаринов в разных растениях колеблется от 0,2 до 10 %, причем часто можно встретить 5-10 кумаринов различной структуры в одном растении.

Качественный и количественный состав кумаринов различен у разных видов внутри одного рода; он изменяется также в онтогенезе растения.

Роль кумаринов в жизнедеятельности растений еще недостаточно выяснена. Согласно существующим в настоящее время теориям одни кумарины являются стимуляторами роста растений, другие, наоборот, ингибиторами роста. Считают также, что кумарины защищают растения от некоторых вирусных заболеваний, а также от чрезмерного солнечного облучения.

 

Физико-химические свойства

 

Физические свойства. Выделенные в индивидуальном состоянии кумарины представляют собой кристаллические вещества, бесцветные или слегка желтоватые. Они обладают приятным запахом, напоминающим запах свежего сена. Кумарины хорошо растворимы в органических растворителях: хлороформе, эфире диэтиловом, спиртах этиловом и метиловом, а также жирах и жирных маслах. В воде кумарины в большинстве случаев нерастворимы; гликозиды же их, как правило, растворимы в воде и нерастворимы в органических растворителях.

При нагревании до 100 ºС кумарины возгоняются с образованием игольчатых кристаллов.

Многие кумарины проявляют очень характерную флуоресценцию (голубую, синюю, фиолетовую, зеленую или желтую) в УФ-свете в нейтральных спиртовых растворах, растворах щелочей и кислоте серной концентрированной. Флуоресценция усиливается при обработке щелочами или парами аммиака. Особенно интенсивно флуоресцируют производные умбеллиферона (7-гидроксикумарина), проявляя ярко-голубую флуоресценцию, что связано с образованием хиноидной структуры в щелочной среде. В УФ- и ИК-областях имеют характерные спектры поглощения.

Химические свойства обусловлены наличием бензольного и лактонного (пиронового) колец. Кумарины вступают в реакции:

1. Реакция разрыва лактонного кольца (лактонная проба). Основана на разрыве лактонного кольца под действием щелочи с образованием солей кислоты орто -гидроксикоричной (орто -кумаровой), растворимых в воде, которые легко окисляются до соединений хиноидной структуры, имеющих желтый цвет. Реакция обратима, т.е. под действием кислот лактонное кольцо вновь замыкается, образуя исходный кумарин. Лактонное кольцо не раскрывается при кипячении с водой и при воздействии карбонатов щелочных металлов.

Это одна из наиболее характерных реакций на кумарины, которая используется как для обнаружения кумаринов в сырье, так и для их очистки.

2. Реакция азосочетания с солями диазония. Продукты щелочного гидролиза (после раскрытия лактонного кольца) образуют в слабощелочной среде соли кислоты цис - орто -гидроксикоричной (кумаринаты), фенольный гидроксил которой ориентирует азогруппу в орто - или пара -положение 6 или 8 с образованием азокрасителя. При избытке диазореактива образуются бидиазосоединения. Окраска азокрасителя зависит от заместителей в исходном кумарине и может варьировать от коричнево-красной до вишневой.

3. Реакция сплавления со щелочью. При сплавлении с кристаллическим натрия гидроксидом происходит разрыв лактонного кольца с образованием простых фенолов (например, резорцина).

4. При повышенном давлении и в присутствии катализатора возможно присоединение водорода в положении 3,4 и гидрирование двойных связей в ароматическом кольце.

 

Оценка качества сырья, содержащего кумарины. Методы анализа

 

Выделяют кумарины из сырья экстракцией органическими растворителями, чаще всего метанолом или этанолом. Спиртовое извлечение очищают от сопутствующих веществ осаждением раствором свинца ацетата основного.

Качественный анализ.

Проводят качественные реакции и хроматографическое исследование, используя способность кумаринов:

- вступать в реакцию разрыва лактонного кольца (лактонная проба);

- давать окрашенные растворы с диазосоединениями;

- флуоресцировать в УФ-свете.

1. Лактонная проба (предложена Г.А. Кузнецовой). Реакция проводится с контрольным опытом. Извлечение, содержащее кумарины, наливают в две пробирки. В одну из них добавляют несколько капель 10 % раствора натрия гидроксида. Обе пробирки нагревают на водяной бане, затем в обе прибавляют по 5 мл дистиллированной воды и хорошо перемешивают. Если в пробирке, куда добавляли щелочь, раствор остался желтым и прозрачным, значит, реакция положительная, так как образуется желтая растворимая в воде соль кислоты кумаровой. В контрольной пробирке при добавлении воды раствор мутнеет, кумарины не растворяются в воде и выпадают в осадок. При подкислении щелочного раствора лактонное кольцо замыкается, и кумарины выпадают в осадок.

2. Реакция образования азокрасителя. Реакция проводится с продуктами, полученными после разрыва лактонного кольца. В пробирку добавляют несколько капель свежеприготовленного диазореактива. Чаще всего в качестве диазореактива используют диазотированную кислоту сульфаниловую. При наличии кумаринов раствор приобретает коричнево-красную или вишневую окраску (образуется азокраситель).

3. Реакция микросублимации. Поскольку, как было отмечено выше, при нагревании до 100 ºС кумарины возгоняются с образованием игольчатых кристаллов, для обнаружения их в сырье можно использовать реакцию микросублимации (методика – как для антраценпроизводных).

Игольчатые кристаллы (возгон) растворяются в спирте, затем проводится диазореакция.

Для идентификации кумаринов используют методы бумажной и тонкослойной хроматографии. При этом используют системы растворителей:

- н-гексан-бензол-метанол (5:4:1);

- петролейный эфир-бензол-метанол (5:4:1);

- н-бутанол-кислота уксусная-вода (4:1:5).

После высушивания хроматограммы сначала просматривают в УФ-свете. Кумарины в зависимости от структуры имеют голубую, синюю, фиолетовую, зеленую, желтую флуоресценцию. Флуоресцирующие пятна кумаринов отмечают, и хроматограммы обрабатывают 10 % спиртовым раствором щелочи, после чего их высушивают в сушильном шкафу при температуре 110-120 ºС в течение 2-3 мин и вновь просматривают в УФ-свете (как правило, флуоресценция усиливается). Затем хроматограммы опрыскивают свежеприготовленным реактивом Паули по Кутачеку (диазореактивом), от действия которого кумарины, в зависимости от структуры, окрашиваются в оранжевый, красно-оранжевый и фиолетовый цвета.

Количественное определение.

По существующей нормативной документации для количественного определения кумаринов в лекарственном растительном сырье используют физико-химические методы анализа.

1. Полярографический метод. Основан на восстановлении кумаринов на ртутно-капельном электроде в альфа -пироновом кольце по месту двойной связи в положении 3,4. Присоединяют галоген - йод, в качестве реактива используют тетраэтиламмония йодид.

Используют для определения содержания фурокумаринов в плодах пастернака посевного. Содержание кумаринов в пересчете на ксантотоксин не менее 1 %.

2. Спектрофотометрический метод. Основан на способности кумаринов поглощать монохроматический свет при определенной длине волны в зависимости от концентрации исследуемого раствора.

Используют для определения содержания простых кумаринов в траве донника лекарственного (не менее 0,4 %) и пиранокумаринов в корневищах и корнях вздутоплодника сибирского (не менее 3 %). Получают хлороформное извлечение из сырья и измеряют у него оптическую плотность с помощью спектрофотометра.

3. Хроматоспектрофотометрический метод. Применяют для определения содержания фурокумаринов в плодах амми большой, псоралеи костянковой и листьях инжира.

Стадии определения:

1. Получение хлороформного извлечения из сырья.

2. Разделение суммы кумаринов методом хроматографии на бумаге в системе растворителей, указанной в нормативной документации.

3. Идентификация кумаринов в УФ-свете по характерному свечению.

4. Элюирование веществ с бумаги. Каждое вещество отдельно элюируют 95 % этанолом.

5. Измерение оптической плотности растворов с помощью спектрофотометра при длине волны, указанной в нормативной документации.

6. Расчет содержания каждого соединения с учетом удельного показателя поглощения.

Плоды амми большой: бергаптена и изопимпинеллина не менее 0,6 %.

Плоды псоралеи костянковой: псоралена и изопсоралена не менее 0,9 %.

Листья инжира: псоралена и бергаптена не менее 0,7 %, отдельно псоралена не менее 0,42 %.