Дослід 3. Визначення наявності білків у розчині методом осадження сульфосаліциловою кислотою.

Принцип методу. Білки легко осаджуються із водного розчину мінеральними, органічними кислотами та солями важких металів. Денатурація і осадження білка кислотами обумовлюється нейтралізацією поверхневого заряду колоїдних частинок білка, руйнуванням гідратаційної оболонки білкових молекул та утворенням комплексних солей білка з кислотами.

Різні органічні кислоти діють на білки по-різному. Особливо чутливою реакцією на наявність білка в розчині є осадження трихлорацетатною та сульфосаліциловою кислотами (чутливість останньої реакції 1: 50 000). Крім того, сульфосаліцилова кислота поряд з високомолекулярними білками, здатна осаджувати низькомолекулярні білки та продукти розпаду білків – поліпептиди та олігопептиди.

Матеріальне забезпечення: пробірки, розчин білка, 20 % розчин сульфосаліцилової кислоти.

Хід роботи. У пробірку вносять 1,0 мл досліджуваного розчину білка та додають 3 – 5 крапель 20 % розчину сульфосаліцилової кислоти. Спостерігають за утворенням осаду білка.

Пояснити отримані результати. Зробити висновок. Звернути увагу на можливість використання органічних і мінеральних кислот для осадження білків із біологічних рідин.

Клініко-діагностичне значення. Реакція з сульфосаліциловою та трихлорацетатною кислотами використовується для якісного та кількісного визначення білка в сечі.

Здатність білка міцно зв’язувати іони важких металів використовують у клінічній практиці. У разі отруєння солями важких металів (ртуті, свинцю) хворому дають випити велику кількість білка (яєчний білок або молоко). У шлунку утворюються нерозчинні комплекси металів з білками, внаслідок чого припиняється всмоктування отрути в кров, послаблюється інтоксикація та посилюється їх виведення з організму.

Контроль виконання лабораторної роботи

1. Назвати оптичні методи дослідження, які використовують у клінічній біохімії:

А. Фотоелектроколориметричні

В. Афінна хроматографія

С. Флюоресцентний аналіз

D. Полярографія

Е. Імуноферментний аналіз

2. Для виявлення функціональних груп (-SH, -NH₂, імідазольних) у білках, ферментах використовують такі методи дослідження:

А. Електрофорез

В. Люмінесцентний аналіз

С. Іонообмінну хроматографію

D. Полярографію

Е. Імуноферментний аналіз

3. Вказати метод, який найдоцільніше використати для фракціонування білків:

А. Люмінесцентний аналіз

В. Електрофорез

С. Іонообмінну хроматографію

 

D. Полярографію

Е.Імуноферментний аналіз

4. З біологічної рідини шляхом висолювання виділили білок, який буде використаний для лікування. Яким методом можна звільнити його від низькомолекулярних домішок?

А. Секвенацією

В. Денатурацією

С. Висолюванням

D. Електрофорезом

Е. Діалізом

 

5. Загальний вміст білка у крові людини становить 100 г/л. Чи відповідає це нормі? Як називається такий стан?

 

6. Загальний вміст білка у крові людини становить 45 г/л. Як називається такий стан та які причини його виникнення?

 

7. У сироватці крові хворого на пієлонефрит виявлено зміни у співвідношенні білкових фракцій. Вкажіть, яким методом можна розділити на фракції білки плазми крові?

 

Приклади тестів „Крок - 1”

1. Чоловік 40 років скаржиться на різку загальну слабість, біль у м’язах та суглобах, підвищення температури тіла до 38,6 ^оС. У крові помірна анемія, прискорена ШОЕ, лейкоцитоз, у сечі помірна протеїнурія, мікрогематурія. Для підтвердження діагнозу хворому призначено протеїнограму білків сироватки крові. Який метод можна використати для розділення білків?

А. Полярографію

В. Імуноелектрофорез

С. Імуноферментний аналіз

D. Хроматографію

Е. ІЧ-спектрофотометрію

2. Тест-система для експрес–діагностики венеричних захворювань дає можливість виявити антиген збудника. Який метод дослідження найдоцільніше використати для цього?

А. Спектрофлюориметрію

В. Адсорбційну хроматографію

С. Імуноелектрофорез

D. Імуноферментний аналіз

Е. Поляриметрію

3. При гістологічному дослідженні щитоподібної залози спостерігають дифузну інфільтрацію тканини лімфоцитами, посилене розростання сполучної тканини. Для встановлення діагнозу визначають рівень тиреоїдних гормонів у сироватці крові. Який метод використовують при цьому:

А. Хроматографію

В. Електрофорез

С. Імуноферментний

D. Біуретовий

Е. Спектрофотометрію

4. У клініці для парентерального білкового харчування використовують фармпрепарати гідролізату білків. Повноцінність гідролізатів визначається за наявністю незамінних амінокислот. Вкажіть, яким методом можна розділити суміш амінокислот?

А. Хроматографією

В. Імуноелектрофорезом

С. Полярографією

D. Інфрачервоною спектроскопією

Е.Імуноферментним аналізом

 

5. Важлива роль в організмі належить трипептиду глутатіону, який складається із залишку глутамінової кислоти, цистеїну та гліцину (γ-глутамілцистеїнілгліцин). Глутатіон бере участь в окисно-відновних реакціях, знешкодженні різноманітних пероксидів, ксенобіотиків, продуктів клітинного метаболізму. Яким методом можна визначити наявність SН–групи в глутатіоні?

А. Полярографією

В. Електрофорезом

С. Фотоелектроколориметрією

D. Гель-фільтрацією

Е. Хроматографією

Індивідуальна самостійна робота студентів

1. Історія розвитку біохімії: становлення біохімії як науки, напрямки розвитку сучасної біохімії.

 

Література

Основна:

1. Губський Ю.І. Біологічна хімія. – Київ; Вінниця: Нова книга, 2007. – 656 с.

2. Гонський Я.І., Максимчук Т. П., Калинський М.І. Біохімія людини. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – 744 с.

3. Біохімічні показники в нормі і при патології /За ред. Склярова О.Я. – К.: Медицина, 2007. – 318 с.

4. Клінічна біохімія / За ред. Склярова О.Я. – Київ: Медицина, 2006. - 432 с.

5. Практикум з біологічної хімії / За ред. О.Я. Склярова. – К.: Здоров’я, 2002. – 298 с.

6. Біологічна хімія. Тести та ситуаційні задачі. (Посібник для студентів медичних вузів) / За ред. Склярова О.Я. – Львів. Світ. - 2006. – 272 с.

Додаткова:

1. Берёзов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1998. – 704 с.

2. Скляров О.Я., Фартушок Н.В., Сойка Л.Д., Смачило І.С.. Біологічна хімія з біохімічними методами дослідження. – К.: Медицина, 2009. – 352 с.

3. Горячковский А.М. Клиническая биохимия. – Одесса: Астропринт, 1998. – 398 c.

4. Камышников В.С. Справочник по клинико- биохимической лабораторной диагностике. Т І. – Мн.: Беларусь, 2000.- 495 с.

5. Кучеренко М.Є., Бабенюк Ю.Д., Войціцький В.М. Сучасні методи біохімічних досліджень. К.: Фітосоціоцентр, 2001. – 424 с.

Змістовий модуль 6. Ферменти та коферменти. Регуляція метаболізму.

Тема № 2. Фізико-хімічні властивості білків-ферментів. Визначення активності ферментів, дослідження механізму їх дії та кінетики ферментативного каталізу.

Мета заняття. Засвоїти принципи організації та загальні властивості ферментів. Оволодіти методом визначення активності амілази слини і на її прикладі вивчити вплив температури та рН середовища на активність ферментів. На прикладі пептидаз панкреатину і амілази слини показати каталітичну роль ферментів у хімічних перетвореннях. Засвоїти методику визначення активності пептидаз і амілази слини та оцінити їх клініко-діагностичне значення.

Актуальність теми. Ферменти – це біологічні каталізатори білкової природи, які забезпечують прискорення і координацію численних метаболічних процесів в живих організмах. Вони різняться за своєю будовою, наявністю небілкових компонентів, локалізацією, різними фізико-хімічними та каталітичними властивостями. Знання механізму дії ферментів та кінетики ферментативного каталізу лежить в основі розуміння метаболічних процесів у клітинах, тканинах та органах організму.

Конкретні завдання.

Ø Аналізувати механізми регуляції основних метаболічних процесів.

Ø Трактувати біохімічні закономірності будови та функціонування різних класів ферментів.

Ø Пояснювати механізм дії ферментів на основі спорідненості ферменту до субстрату та процесів, що перебігають у фермент-субстратному комплексі.

Ø Аналізувати зміни активності індикаторних ферментів плазми крові при патологіях певних органів та тканин.

 

Теоретичні питання

1. Ферменти як біологічні каталізатори реакцій обміну речовин.

2. Фізико-хімічні властивості білків-ферментів: поверхневий заряд молекули, розчинність, термодинамічна стабільність білкових молекул-ферментів, осадження, денатурація, взаємодія з лігандами та її функціональне значення.

3. Прості та складні білки-ферменти, простетичні групи складних білків-ферментів (кофактори, коферменти).

4. Будова ферментів: активний, регуляторний (алостеричний) центри.

5. Рівні структурної організації ферментів. Мультиферментні комплекси, ферментативні ансамблі, поліфункціональні ферменти, їх переваги.

6. Номенклатура та класифікація ферментів. Типи реакцій, що каталізують окремі класи ферментів.

7. Механізм дії та кінетика ферментативних реакцій: залежність швидкості реакції від температури, рН середовища, концентрації субстрату та фермента.

8. Види специфічності дії ферментів.

9. Внутрішньоклітинна локалізація ферментів, тканинна (органна) специфічність ферментів.

10. Ферменти слини.

11. Ізоферменти, множинні молекулярні форми ферментів.

12. Принципи та методи виявлення ферментів у біооб’єктах. Одиниці виміру активності та кількості ферментів.

 

Практична робота