Дослід 1. Якісна реакція на ацетон та ацетоацетатну кислоту (проба ланге).

Принцип методу. Ацетон та ацетоацетатна кислота з натрію нітропрусидом в лужному середовищі утворюють продукти реакції, забарвлені в червоний колір:

 

CH₃ – CO – CH₃ + Na₂ [Fe (CN)₅ NO] + 2 NaOH → Na₄ [Fe (CN)₅ NO = CHCOCH₃] + 2 H₂O

 

Під дією концентрованої ацетатної кислоти утворюється продукт вишнево-червоного кольору:

 

Na₄ [Fe (CN)₅ NO =CHCOCH₃] + CH₃COOH →Na₃ [Fe (CN)₅ NOCH₃COCH₃] + CH₃COONa

 

Ацетоацетатна кислота (в енольній формі) здатна також утворювати з феруму хлоридом (III) комплексну сполуку вишнево-червоного кольору.

Матеріальне забезпечення: сеча хворого на цукровий діабет і сеча здорової людини, 10 % розчин натрію нітропрусиду (свіжоприготовлений), крижана ацетатна кислота, 10 % розчин NaOH, 50 % розчин амонію сульфату, концентрований розчин аміаку, 10 % розчин феруму хлориду (ІІІ), піпетки, пробірки, лійка, фільтрувальний папір.

Хід роботи.

1. Реакція з натрію нітропрусидом (проба Ланге). У 4 пробірки наливають по 0,5 мл досліджуваної сечі, додають по 0,5 мл розчину натрію гідроксиду і 5-7 крапель натрію нітропрусиду. Спостерігають за появою червоного забарвлення, що набуває вишневого відтінку після додавання декількох крапель концентрованої ацетатної кислоти.

2. Реакція з феруму хлоридом (III) (проба Герхарда). У 4 пробірки наливають по 2,0 мл досліджуваної сечі і додають по краплях 10 % розчин феруму хлориду (III) до припинення утворення осаду фосфатів. Осад відфільтровують, до фільтрату додають ще декілька крапель FeCl₃ та спостерігають за появою вишневого забарвлення.

Зробити висновок.

Дослід 2. Кількісне визначення кетонових тіл у сечі.

Принцип методу. Див. попередній дослід.

Матеріальне забезпечення: див. попередній дослід.

Хід роботи. Беруть 8 пробірок. У всі, крім першої, наливають по 1мл дистильованої води. У першу та другу пробірки додають по 1 мл сечі хворого на цукровий діабет. Таким чином, у першій пробірці сеча не розведена, а в другій розведена у двічі. Після перемішування з другої пробірки відбирають 1 мл суміші і переносять у третю пробірку, з третьої в четверту і т. д. З останньої пробірки 1 мл виливають для урівнювання об’єму з іншими пробірками. Таким чином, сеча в пробірках буде розведеною у 2, 4, 8 (і т. д.) разів.

Потім у кожну пробірку додають по 8 крапель 50 % розчину амонію сульфату для збільшення густини розчинів, по 8 крапель ацетатної кислоти (концентрованої) та натрію нітропрусиду. Вміст пробірок перемішують і в кожну з них обережно по стінках, починаючи з останньої пробірки, нашаровують по 1 мл концентрованого аміаку (реактив відбирати обережно лише за допомогою гумової груші, працюючи з ним під витяжною шафою). Спостерігаючи за пробірками, позначають ту з них, у якій при максимальному розведенні сечі впродовж 3 – 4 хв ще помітне фіолетове кільце на межі рідин. Звернути увагу, що для успішного проведення досліду аміак необхідно нашаровувати обережно, по стінках. Акцентувати увагу на термін отримання фіолетового кільця.

Розрахунок проводять за формулою:

Х = 0,85 ´ А ´ 15,

де: Х – концентрація ацетону в сечі, мг/добу;

0,85 – емпіричне число;

А – розведення сечі;

15 – перерахунок на добовий діурез (1500 мл).

Після проведення розрахунків зробити висновок.

Клініко-діагностичне значення. У здорової людини в крові вміст кетонових тіл – 1,3 – 185 мкмоль/л (1,5 – 20 мг/л), з сечею виділяється 20 – 40 мг на добу. Це переважно ацетоацетатна і b-оксимасляна кислоти. Різке зростання концентрації кетонових тіл супроводжується порушенням кислотно-основного стану і розвитком метаболічного кетоацидозу, що є небезпечним, в першу чергу, для нормального функціонування клітин головного мозку.

Збільшення кількості кетонових тіл у крові (кетонемію) і появу їх у сечі (кетонурію) спостерігають при цукровому діабеті, тиреотоксикозі, ураженні печінки, важких інтоксикаціях, голодуванні. Зниження кількості кетонових тіл не має клінічного значення.

 

Контроль виконання лабораторної роботи

1. У чому полягає принцип методу визначення кетонових тіл (проба Ланге)?

A. У здатності ацетону утворювати фіолетове кільце з натрію нітропрусидом при нашаруванні аміаку

B. В утворенні забарвлених продуктів конденсації з оксиметилфурфуролом

C. У здатності утворювати дрібнодисперсну емульсію

D. В утворенні забарвленого триметинового комплексу при реакції з тіобарбітуровою кислотою

E.У здатності за присутності ацетатного ангідриду і суміші ацетатної і сульфатної кислот утворювати сполуку зеленого кольору

2. Вказати вміст кетонових тіл у крові за умов норми:

A. 2,5 – 8 мкмоль/л

B. 0 – 2,5 мкмоль/л

C. 180 – 250 мкмоль/л

D. 13 – 185 мкмоль/л

E. 205 – 317 мкмоль/л

3. Яку пробу використовують для виявлення в сечі ацетоацетату?

A. Проба Герхардта

B. Проба Барфуда

C. Проба Богомолова

D. Проба Петенкофера

E. Проба Гмеліна

4. На чому ґрунтується виявлення кетонових тіл за пробою Герхардта?

A. На здатності утворювати червоне забарвлення з оксиметил-фурфуролом

B. На здатності утворювати із феруму хлоридом (Ш) сполуку червоного кольору

C. На окисненні бензидину киснем

D. На утворенні феруму лактатом жовто-зеленого кольору

E.На здатності утворювати червоне забарвлення з діазореактивом

 

5. У раціоні людини відсутні рослинні олії. До яких наслідків це може призвести?

 

6. У крові людини виявлено високу концентрацію вільних жирних кислот. Які причини цього явища?

 

7. У добовій сечі виявлено 120 мг кетонових тіл. Які причини і наслідки такого стану для організму?

 

Приклади тестів „Крок-1”

1.Жири є необхідним енергетичним матеріалом для організму. Який основний шлях перетворення жирних кислот у мітохондріях клітини?

A. Відновлення

B. Декарбоксилування

C. b-Окиснення

D. a-Окиснення

E. g-Окиснення

2. При цукровому діабеті та голодуванні в крові збільшується вміст ацетонових тіл, які використовуються як енергетичний матеріал. Назвіть речовину, з якої вони синтезуються?

А. Цитрат

В. Ацетил-КоА

С. Сукциніл-КоА

Д. a-Кетоглутарат

Е. Малат

 

3. Після тривалого голодування у крові людини спостерігається підвищення вмісту кетонових тіл. Це зумовлено:

A. Зниженням рівня вільних жирних кислот у сироватці крові

B. Мобілізацією ліпопротеїнів високої густини

C. С. Утворенням ацетил-КоА

D. Збільшенням окиснення жирних кислот у печінці

E. Зниженням мобілізації триацилгліцеролів у жировій тканині

4. У хворого на цукровий діабет у крові виявлено ацетон. Яким чином він утворюється в організмі?

A. У процесі a-окиснення жирних кислот

B. У процесі b-окиснення жирних кислот

C. При конденсації двох молекул ацетил – КоА

D. У процесі g-окиснення жирних кислот

E. У циклі Кребса

 

Література

Основна:

1. Губський Ю.І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – 508 с.

2. Гонський Я.І., Максимчук Т.П. Біохімія людини. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – 744 с.

3. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1998. – 743 с.

4. Біохімічні показники в нормі і при патології / За ред. О.Я. Склярова – К.: Медицина, 2007. – 320 с.

5. Клінічна біохімія / За ред. Склярова О.Я. – Київ: Медицина, 2006. - 432 с.

6. Біологічна хімія. Тести та ситуаційні задачі. / За ред. О.Я. Склярова. – Львів: Світ, 2006. – 271 с.

Додаткова:

1. Колосова Н.Г. Возрастные изменения окислительности белков и липидов в печени преждевременно стареющих крыс // Биомед. химия. – 2004. – Т. 50, № 1. – С. 73 – 78.

2. Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия. – М.: Мир, 2000. – 469 с.

Тема № 11. Дослідження біосинтезу та біотрансформації холестеролу. Патології ліпідного обміну.

Мета заняття. Вивчити шляхи біотрансформації холестеролу та основні порушення ліпідного обміну.

Актуальність теми. Порушення процесів біотрансформації холестеролу зумовлює низку захворювань, серед яких атеросклероз, ожиріння тощо. Тому дослідження показників ліпідного обміну є необхідним для діагностики та лікування різних захворювань.

Конкретні завдання.

Ø Трактувати етапи біосинтезу холестеролу.

Ø Пояснювати регуляцію синтезу холестеролу в організмі людини.

Ø Аналізувати шляхи біотрансформації холестеролу: етерифікацію, утворення жовчних кислот, стероїдних гормонів, вітаміну D₃; екскреція холестеролу з організму.

Ø Аналізувати зміни в системі циркуляторних транспортних ліпідів: ХМ, ЛПДНЩ, ЛПНЩ, ЛПВЩ при патологіях, пояснювати їх функціональне значення.

Ø Пояснювати біохімічні основи виникнення та розвитку генетичних аномалій обміну ліпідів, ліпопротеїнів, холестеролу (ліпопротеїнемії), а також набуті порушення обміну ліпідів: атеросклероз, ожиріння, цукровий діабет.

Теоретичні питання

1. Біосинтез холестеролу в організмі людини: локалізація цього процесу, значення; етапи синтезу холестеролу; ферментативні реакції синтезу мевалонової кислоти; регуляція синтезу холестеролу.

2. Шляхи біотрансформації холестеролу (етерифікація, утворення жовчних кислот та стероїдних гормонів, синтез вітаміну D₃, екскреція з організму).

3. Атеросклероз: механізми розвитку, роль генетичних факторів, гіперхолестеринемії, класифікація ВООЗ.

4. Порушення ліпідного обміну при цукровому діабеті.

5. Патологічні процеси обміну ліпідів, які призводять до розвитку ожиріння. Жировий гепатоз, ліпотропні фактори.

6. Ліпопротеїни плазми крові: ліпідний та білковий (апопротеїни) склад. Гіперліпопротеїнемії.

Практична робота

Дослід 1. Якісна реакція на жовчні кислоти (реакція Петенкофера).

Принцип методу. Реакція базується на утворенні забарвлених продуктів конденсації у разі взаємодії жовчних кислот з оксиметилфурфуролом. Останній утворюється з фруктози, що є продуктом гідролізу внаслідок додавання до сахарози концентрованої сульфатної кислоти.

Матеріальне забезпечення: жовч, 20 % розчин сахарози, концентрована Н₂SO₄, пробірки.

Хід роботи. У пробірку наливають 5 – 6 крапель жовчі, додають 10 – 15 крапель свіжого розчину сахарози і злегка струшують. В іншу пробірку вміщують 10 – 15 крапель сульфатної кислоти. Розчин, що містить жовч, нашаровують на сульфатну кислоту. На межі розподілу рідин утворюється осад жовчних кислот і з’являється червоно-фіолетове кільце. У разі обережного струшування рідина набуває вишнево-червоного забарвлення.

Зробити висновок.

Клініко-діагностичне значення. Головним емульгатором ліпідів є жовч, яка містить жовчні кислоти, що утворюються в печінці (10 – 15 г за добу). До них належать: холева, дезоксихолева, хенодезоксихолева, літохолева тощо. Вони виділяються з жовчю у вільному стані та у вигляді парних жовчних кислот, зв’язаних з гліцином або з таурином. Жовчні кислоти емульгують ліпіди, активують панкреатичну ліпазу, беруть активну участь у процесі всмоктування жирних кислот, утворюють холеїнові комплекси, стабілізують холестерол. Дефіцит жовчі в кишці може бути пов’язаний із захворюваннями печінки (механічна жовтяниця, гепатити, цироз), жовчного міхура або жовчних шляхів (жовчнокам’яна хвороба, пухлини жовчовивідних шляхів). При цьому копрологічні дослідження виявляють зменшення або відсутність у калі жовчних пігментів (ахолічний кал) та високий вміст мил, особливо кальцієвих.