Дослід 2. Вплив жовчі на активність ліпази.

Принцип методу. Активність ліпази оцінюють за утворенням жирних кислот у результаті гідролізу жиру. Їх кількість визначають титруванням лугом у присутності фенолфталеїну. Гідроліз жирів найзручніше спостерігати на прикладі витяжки з підшлункової залози (джерело ліпази) і молока як субстрату, жир якого знаходиться в емульгованому стані і швидко розщеплюється на гліцерин і жирні кислоти. Якщо в пробу долити жовч, то ліпаза активується і гідроліз жиру протікає швидше.

Матеріальне забезпечення: панкреатин, молоко кип’ячене і попередньо розведене 1:1, жовч, 0,5 % спиртовий розчин фенолфталеїну, 0,05 н NaOH, водяна баня або термостат, мікробюретки, піпетки.

Хід роботи. У дві пробірки або колбочки наливають по 10 мл молока та по 0,5 мл панкреатину. В одну пробірку доливають 1 мл води, а в другу – 1 мл жовчі. Вміст пробірок добре перемішують. З кожної пробірки відбирають по 1 мл суміші в інші пробірки, додають 1 – 2 краплі 0,5 % розчину фенолфталеїну і відразу ж титрують 0,05 н розчином натрію гідроксиду до появи слаборожевого забарвлення, яке не зникає впродовж 30 секунд. Потім ці пробірки із залишком суміші вміщують у водяну баню або термостат при 37 С. Через кожні 10 – 15 хвилин з них відбирають по 1 мл суміші і проводять титрування, як і попереднього разу. Роблять 4 – 5 таких визначень. Результати виражають у мл розчину лугу, який затрачається на титрування.

Отримані дані вносять в таблицю і будують криву, відкладаючи по осі абсцис час у хв, а по осі ординат – кількість NаОН в мл, використана на титрування.

Умови досліду	0 хв	15 хв	30 хв	45 хв	60 хв
Кількість NаОН, мл
Ліпаза, активована жовчю
Ліпаза без жовчі

 

Клініко-діагностичне значення. Перетравлення ліпідів відбувається, в основному, в кишці під дією активної панкреатичної ліпази, тому що в шлунковому соку ліпаза малоактивна. Ліпіди мають бути емульговані. Головним емульгатором ліпідів є жовч, при додаванні якої ліпаза активується і гідроліз жирів відбувається з більшою швидкістю. Оскільки ліпаза є основним ензимом для перетравлення ліпідів, зміни її активності можуть свідчити про порушення певних ланок ліпідного обміну. Дефіцит панкреатичної ліпази викликає панкреатогенну стеаторею, яку спостерігають при хронічному панкреатиті, спадковій гіпоплазії pancreas, спадковому чи набутому дефіциті панкреатичної ліпази, а також при муковісцидозі. Вміст жовчних пігментів у калі при таких станах супроводжується зниженням вмісту вільних жирних кислот і значним приростом нерозщеплених жирів. Причиною порушення емульгування, травлення і всмоктування ліпідів і жиророзчинних вітамінів можуть також бути захворювання печінки, жовчного міхура або жовчних шляхів (жовчнокам’яна хвороба).

 

Контроль виконання лабораторної роботи

1. У чому полягає принцип методу визначення фосфоліпідів у сироватці крові?

A. В осадженні фосфоліпідів трихлорацетатною кислотою і визначенні вмісту фосфору

B. В утворенні комплексної сполуки за присутності ацетатного ангідриду та суміші ацетатної і сульфатної кислот

C. В утворенні забарвлених продуктів з оксиметилфурфуролом

D. В утворенні синього забарвлення з 2,6-дихлорфеноліндофенолом і відновленні аскорбіновою кислотою

E. В утворенні з 2-тіобарбітуровою кислотою забарвленого триметинового комплексу

2. Вказати вміст загальних фосфоліпідів за умов норми:

A. 0,25 – 1,25 г/л

B. 1,52 – 3,62 г/л

C. 3,75 – 5,40 г/л

D. 10,15 – 12,30 г/л

E. 9,80 – 15,72 г/л

3. Яким чином можна оцінити активність ліпази?

A. За здатністю ензиму гідролізувати пептидні зв’язки

B. За кількістю утвореної піровиноградної кислоти

C. За здатністю знебарвлювати метиленову синьку при її відновленні альдегідом

D. За утворенням в результаті гідролізу жирних кислот, кількість яких визначають титруванням в присутності фенолфталеїну

E. За здатністю інгібувати відновлення нітротетразолію синього у присутності НАДН₂

4. Людина тривалий час обмежує вживання продуктів, що містять фосфоліпіди. До яких метаболічних порушень це може призвести?

 

5. При аналізі сироватки крові людини виявлено: вміст загального холестеролу – 5 ммоль/л, фосфоліпідів – 3,2 ммоль/л, тригліцеридів – 1,5 ммоль/л. Чи відповідають ці показники нормі? Як називається такий стан і коли він буває?

 

6. Концентрація фосфоліпідів у крові становить 0,7 г/л. Як називається такий стан і про які метаболічні порушення свідчить?

Приклади тестів „Крок-1”

1. Потерпілий від укусу гадюки ледь не помер внаслідок інтенсивного гемолізу. Аналіз крові показав незвично високий вміст лізолецитину. Токсичний ефект був обумовлений наявністю у зміїній отруті:

A. Фосфоліпази А₁

B. Фосфоліпази А₂

C. Фосфоліпази С

D. Фосфоліпази Д

E. Нейрамінідази

2. У хворих на цукровий діабет спостерігається підвищення вмісту вільних жирних кислот (НЕЖК). Причиною цього може бути:

A. Накопичення в цитозолі пальмітоїл-КоА

B. Активація утилізації кетонових тіл

C. Активація синтезу аполіпопротеїнів А₁, А₂, А₄

D. Зниження активності фосфатидилхолінхолестеринацил-трансферази плазми крові

E. Підвищення активності тригліцеридліпази

3. При лабораторному обстеженні крові хворого, взятої натще, виявлено, що сироватка має білуватий колір, вміст загальних ліпідів – 20 г/л, холестеролу – 9 мМ/л. Після центрифугування сироватки на поверхні утворюється біла плівка, що дозволяє припустити збільшення в крові хіломікронів. Зниження активності якого ферменту може спричинити таке явище?

A. Ліпази підшлункової залози

B. Панкреатичних фосфоліпаз

C. Ліпопротеїнліпази крові

D. Ліпази жирової тканини

E. Лецитинхолестеринтрансферази

4. Внаслідок тривалого вживання жирної їжі у хворого розвинулася аліментарна гіперліпемія, яка, головним чином, може бути наслідком підвищення вмісту:

A. Фосфоліпідів

B. Холестеролу

C. Гліколіпідів

D. Хіломікронів

E. Тригліцеридів

5. Після прийому жирної їжі у хворого з’являються нудота та печія, має місце стеаторея. Причиною такого стану може бути:

A. Недостатність амілази

B. Підвищення виділення ліпази

C. Порушення синтезу фосфоліпази

D. Порушення синтезу трипсину

E. Недостатність жовчних кислот

 

Література

Основна:

1. Губський Ю.І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – 508 с.

2. Гонський Я.І., Максимчук Т.П. Біохімія людини. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – 744 с.

3. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1998. – 743 с.

4. Біохімічні показники в нормі і при патології / За ред. О.Я. Склярова – К.: Медицина, 2007. – 320 с.

5. Клінічна біохімія / За ред. Склярова О.Я. – Київ: Медицина, 2006. – 432 с.

6. Біологічна хімія. Тести та ситуаційні задачі. / За ред. О.Я. Склярова. – Львів: Світ, 2006. – 271 с.

Додаткова:

1. Асинова М.И., Белая И.И. Липидный обмен и социальная адаптация человека при старении // Клин. геронтология. – 2001. – № 7. – С. 18 – 22.

2. Красильников О.А. Роль ионов Са в реализации быстрых эффектов L-тироксина на обмен фосфоинозитидов в клетках печени крыс / Биохимия. – 2003. – Т. 68, № 7. – С. 946 – 953.

Тема № 10. β-Окиснення та біосинтез жирних кислот. Дослідження обміну кетонових тіл.

Мета заняття. Вивчити процеси біосинтезу та окиснення жирних кислот. Знати метаболізм кетонових тіл в нормі та при патології і вміти визначати їх вміст у сечі.

Актуальність теми. Окиснення ліпідів і метаболізм кетонових тіл є важливою складовою метаболізму, що забезпечує організм людини резервами метаболічного палива у вигляді енергії АТФ. Визначення вмісту кетонових тіл у крові та сечі має важливе значення для діагностики низки патологічних процесів.

Конкретні завдання.

Ø Трактувати біохімічні закономірності β-окиснення вищих жирних кислот.

Ø Трактувати біохімічні закономірності біосинтезу вищих жирних кислот і його регуляцію на рівні ацетил-КоА-карбоксилази та синтетази жирних кислот.

Ø Аналізувати метаболізм кетонових тіл.

Ø Пояснювати механізми надмірного зростання вмісту кетонових тіл при цукровому діабеті та голодуванні.

 

Теоретичні питання

1. Реакції β-окиснення жирних кислот: локалізація процесу; активація жирних кислот; роль карнітину в транспорті жирних кислот у мітохондрії; послідовність ферментативних реакцій та енергетична вартість β-окиснення жирних кислот.

2. Окиснення гліцеролу: ферментативні реакції, біоенергетика.

3. Біосинтез вищих жирних кислот: локалізація процесу; метаболічні джерела синтезу жирних кислот; стадії синтезу насичених жирних кислот; характеристика синтетази ВЖК, значення ацилтранспортуючого білка, біотину; джерела НАДФН; послідовність ферментативних реакцій біосинтезу вищих жирних кислот; регуляція процесу біосинтезу на рівні ацетил-КоА-карбоксилази та синтетази жирних кислот; елонгація насичених жирних кислот; біосинтез моно- та поліненасичених жирних кислот в організмі людини.

4. Метаболізм кетонових тіл: ферментативні реакції біосинтезу кетонових тіл; реакції утилізації кетонових тіл, енергетичне значення; метаболізм кетонових тіл в умовах патології; механізми надмірного зростання вмісту кетонових тіл при цукровому діабеті та голодуванні; поняття – кетоацидоз, кетонемія, кетонурія.

 

Практична робота