Дослід 1. Визначення активності аланінамінотрансферази (АлАТ) уніфікованим динітрофенілгідразиновим методом Райтмана-Френкеля.

Принцип методу. У результаті реакції трансамінування під дією АлАТ утворюються піруват і глутамат. При додаванні 2,4-динітрофенілгідразину в лужному середовищі утворюється гідразон піровиноградної кислоти червоно-бурого забарвлення, інтенсивність якого прямопропорційна кількості утвореної піровиноградної кислоти і є показником активності АлАТ.

Матеріальне забезпечення: 0,1 М розчин Na₂HPO₄; 0,1 М розчин КН₂РО₄; 0,1 М фосфатний буфер рН 7,4; 0,4 М розчин NаОН; 0,04 % розчин бромтимолового синього; субстратний розчин (29,2 мг α-кетоглутарової кислоти і 1,78 мг D,L-аланіну розчиняють в 1 М NаОН до отримання рН 7,4, розчин переливають у мірну колбу на 100 мл і доводять 0,1 М фосфатним буфером до мітки); 1 М розчин хлоридної кислоти; 1 мМ розчин 2,4-динітрофенілгідразину; натрію піруват. Визначення проводять за допомогою спектрофотометра або фотоелектроколориметра. Необхідні термостат або водяна лазня, холодильник.

Приготування калібрувального розчину: 11 мг натрію пірувату розчиняють у невеликій кількості води, переносять у мірну колбу на 100 мл і доводять водою до мітки: 1 мл калібрувального розчину містить 110 мкг натрію пірувату, що відповідає 88 мкг або 1 мкмоль піровиноградної кислоти.

Хід роботи. 1) Дослідна проба: у пробірку вносять 0,5 мл субстратного розчину і 0,1 мл досліджуваної сироватки. Пробірку ставлять у термостат при 37⁰С на 30 хв. Додають 0,5 мл розчину 2,4-динітрофенілгідразину і витримують 20 хв. при кімнатній температурі. Потім додають 5 мл 0,4 М NaOН, перемішують і залишають на 10 хв при кімнатній температурі для розвитку забарвлення. Інтенсивність забарвлення визначають на фотоелектроколориметрі при зеленому світлофільтрі (λ = 546 нм) у кюветі з товщиною шару 10 мм проти контрольної проби.

2) Контрольна проба: у пробірку вносять 0,5 мл субстратного розчину, 0,1 мл сироватки і 0,5 мл розчину 2,4-динітрофенілгідразину і витримують 20 хв. при кімнатній температурі. Потім додають 5 мл 0,4 М NaOН і далі все виконують аналогічно дослідній пробі.

Побудова калібрувального графіка: з калібрувального розчину готують низку розведень (див. табл.). Калібрувальні проби проводять так само як і дослідні, але замість сироватки додають розведені калібрувальні розчини. Вимірюють проти холостої проби, в яку замість калібрувальних розчинів додають воду. Визначивши оптичну густину розчинів будують калібрувальний графік, відкладаючи на осі абсцис активність ферменту, а на осі ординат – значення оптичної густини. Калібрувальна крива лінійна до величини оптичної густини 0,3.

Отримання калібрувальних розчинів:

№ проби	Калібрувальний розчин натрію пірувату, мл	Дистильована вода, мл	Піровиноградна кислота	Активність АлАТ, нмоль/(с.л)
мкг	мкмоль
	0,05	0,55	4,4	0,05
	0,10	0,50	8,8	0,10
	0,15	0,45	13,2	0,15
	0,20	0,40	17,6	0,20
	0,25	0,35	22,0	0,25

 

Кількість утвореної піровиноградної кислоти (у мкг) знаходять за калібрувальним графіком або за формулою І:

Активність АлАТ вираховують за формулою ІІ:

 

де: Х – кількість піровиноградної кислоти, знайденої за калібрувальним графіком або за формулою І, мкг;

2 – коефіцієнт перерахунку на 1 год інкубації;

10 – коефіцієнт перерахунку на 1 мл сироватки;

88 – маса 1 мкмоль піровиноградної кислоти.

Зробити висновок.

Клініко-діагностичне значення. В організмі людини процес трансамінування активний у печінці, серці, скелетних м’язах, нирках та інших органах. У сироватці крові активність амінотрансфераз дуже низька. При порушенні цілісності клітинних мембран (цитолізі) амінотрансферази проникають із клітин у кров. Тому визначення активності амінотрансфераз у сироватці крові є важливим тестом для діагностики тих захворювань, для яких характерний цитолітичний синдром (інфаркт міокарда, захворювання печінки тощо).

Нормативні величини для трансаміназ сироватки крові: АлАТ (КФ 2.6.1.2) – 0,1 – 0,68 мкмоль/(год.мл) при 37 ^оС, або 4 – 36 МО/л, або 28 – 190 нмоль/(с·л); АсАТ (КФ 2.6.1.1) – 0,1 – 0,45 мкмоль/(год.мл) або 8 – 33 МО/л, або 28 – 125 нмоль/(с·л).

Найвища активність АлАТ характерна для захворювань запального типу, наприклад, захворювань печінки – особливо в інкубаційному періоді інфекційного гепатиту. Активність АсАТ у сироватці крові найвища при захворюваннях некротичного типу - у крові зростає через 4 – 6 год після інфаркту міокарда і звичайно повертається до норми на 3 – 7 день. При стенокардії АсАТ залишається в нормі. Зниження нормальних показників амінотрансфераз у плазмі може бути при недостатності вітаміну В₆, а також при нирковій недостатності.

Діагностично важливим є одночасне визначення активності АлАТ і АсАТ та розрахунок коефіцієнта де Рітіса – АсАТ/АлАТ, який в нормі дорівнює приблизно 1,3. При інфекційному гепатиті він нижчий за норму (за рахунок значного зростання АлАТ), а при інфаркті міокарда – вищий (за рахунок значного зростання АсАТ).