Дослід 4. Кількісне визначення активності амілази сечі за методом Вольгемута.

Принцип методу. Метод Вольгемута ґрунтується на здатності амілази розщеплювати (гідролізувати) крохмаль. В ході роботи виявляють мінімальну кількість ферменту, здатного повністю розщеплювати 1 мл 0,1 % розчину крохмалю. Цю кількість ферменту приймають за одиницю амілазної активності.

Амілазну активність виражають в кількості мл 0,1 % розчину крохмалю, яку може розщепити (гідролізувати) 1 мл нерозведеної сечі при температурі 45^оС впродовж 15 хв.

Матеріальне забезпечення: сеча, 0,1 % р-н крохмалю, 0,1 % розчин I₂ в 0,2 % розчині KI, 0,85 % р-н NaCl, газовий пальник, водяна баня, штатив з пробірками, піпетки.

Хід роботи. У дев’ять пронумерованих пробірок вносять з бюретки по 1 мл 0,85 % р-н NaCl. У першу пробірку додають 1 мл сечі. Вміст добре перемішують і 1 мл з отриманого розчину першої пробірки переносять в другу, з неї – в третю, тощо. Таким чином у кожній наступній пробірці вміст ферменту в два рази менший, ніж у попередній. З останньої пробірки 1 мл суміші виливають для зрівняння об’єму. Потім в усі пробірки додають ще по 1 мл 0,85% р-ну NaCl та по 2 мл 0,1% розчину крохмалю, перемішують та ставлять пробірки у водяну баню (чи термостат) при 45°С на 15 хв.

Після інкубації пробірки виймають та охолоджують для зупинки дії ферменту. В кожну пробірку додають по 2 краплі розчину йоду (0,1% розчин йоду в 0,2 % розчині йодиду калію), перемішують та спостерігають за зміною забарвлення. Рідина в пробірках може забарвлюватися у жовтий, червоний та синій кольори. Жовтий колір свідчить про повне розщеплення крохмалю. Результати спостережень вносять в таблицю, позначаючи синє, червоне та жовте забарвлення літерами “С”, “Ч”, “Ж”. Відмічають останню пробірку з розчином жовтого кольору та проводять розрахунок амілазної активності в сечі:

Показник	№ пробірки
Розведення сечі
Кількість 0,1 % розчину крохмалю, мл
Забарвлення після додавання йоду
Остання пробірка жовтого кольору

 

Для розрахунку активності амілази необхідно знати розведення сечі в останній пробірці, де відбувся повний гідроліз крохмалю.

Наприклад, остання пробірка з розчином жовтого кольору виявляється четвертою (у ній сеча розведена у 16 разів). Складають пропорцію та розраховують активність амілази:

1/16 мл сечі розщеплює 2 мл 0,1 % розчину крохмалю;

1мл сечі розщеплює - Х мл 0,1 % розчину крохмалю,

А отже: А (амілазна активність) = 32 одиниці.

Зробити висновки з проведених досліджень.

Клініко-діагностичне значення. Метод Вольгемута широко використовують в клінічній практиці для визначення амілазної активності в крові та сечі. У нормі активність амілази сечі коливається в межах 16-18 одиниць. При гострих панкреатитах активність амілази сечі та сироватки крові зростає в 10-30 разів, особливо впродовж першої доби захворювання, потім поступово повертається до норми.

Контроль виконання лабораторної роботи

1. Що відбувається з ферментами за умов високої температури?

А. Гідроліз

В. Денатурація

С. Утворення фермент-

субстратного комплексу

D. Блокування активного центру

Е. Порушення первинної структури

2. Пригнічення швидкості ферментативної реакції при надмірній концентрації субстрату пов’язане з:

А. Блокуванням алостеричного центра

В. Денатурацією ферменту

С. Насиченням алостеричних центрів

D. Насиченням активного центру

Е. Підвищенням температури середовища

3. Яке явище лежить в основі механізму дії ферментів?

А. Утворення фермент-субстратного комплексу

В. Зближення груп, що входять до активного центру ферментів

С. Зміна просторової конфігурації

D. Зниження електричного заряду ферменту

Е. Гідроліз ферменту

 

4. Для збереження трансплантантів їх заморожують. Обґрунтуйте такі дії.

 

5. Поясніть термолабільність ферментів на прикладі визначення амілази слини, яка була попередньо нагріта або охолоджена, та амілази слини, яка не була попередньо оброблена.

 

6. У хворого розвинувся метаболічний ацидоз. Як це вплине на активність внутрішньоклітинних ферментів?

 

Приклади тестів „Крок-1”

1. У слині міститься фермент, здатний руйнувати α-l,4-глікозидні зв’язки в молекулі крохмалю. Назвіть цей фермент.

A. α-Амілаза

B. Фосфатаза

C. Фруктофуранозидаза

D. β-Галактозидаза

Е. Лізоцим

 

2. Важливим ферментом слини є лужна фосфатаза. До якого класу ферментів вона належить?

А. Оксидоредуктаз

В. Трансфераз

С. Гідролаз

D. Ліаз

Е. Лігаз

3. Після додавання витяжки з підшлункової залози в пробірку з розчином крохмалю, відмічено відсутність синього забарвлення в пробі з розчином йоду, що свідчило про гідроліз крохмалю. Під впливом якого ферменту підшлункової залози це відбулося?

А. α-Амілази

В. Хімотрипсину

С. Ліпази

D. Альдолази

Е. Трипсину

4. Амілолітичні ферменти каталізують гідроліз полісахаридів і олігосахаридів. На який хімічний зв’язок вони діють?

A. Глікозидний

B. Складноефірний

C. Пептидний

D. Амідний

Е. Фосфодіефірний

 

5. Протеолітичні ферменти травного тракту каталізують гідроліз білків. Вкажіть, який хімічний зв’язок вони розщеплюють:

A. Пептидний

B. Глікозидний

C. Водневий

D. Ефірний

Е. Фосфодіефірний

 

Індивідуальна самостійна робота студентів

1. Мультиферментні комплекси, особливості будови та каталізу.

 

Література

Основна:

1. Губський Ю. І. Біологічна хімія. – Київ-Тернопіль: Укрмедкнига, 2000. – 508 с.

2. Гонський Я.І., Максимчук Т.П., Калинський М.І. Біохімія людини. – Тернопіль: Укрмедкнига, 2002. – 744 с.

3. Біохімічні показники у нормі і при патології. Навчальний довідник / За ред. Склярова О.Я. – К.: Медицина, 2007. – 320 c.

4. Клінічна біохімія / За ред. Склярова О.Я. – Київ: Медицина, 2006. - 432 с.

5. Практикум з біологічної хімії / За ред. О.Я. Склярова. – К.: Здоров’я, 2002. – С. 3 – 46.

6. Біологічна хімія. Тести та ситуаційні задачі. / За ред. О.Я. Склярова. – Львів: Світ, 2006. – 271 с.

Додаткова:

1. Ангельскі С., Якубовскі З., Домінічак М. Г. Клінічна біохімія. – Сопот, 1998. – 451 с.

2. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия. – М.: Медицина, 1990. – 528 с.

3. Кольман Я., Рем К.-Г. Наглядная биохимия. – Москва: Мир, 2000. – 470 с.

4. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека. – Москва: Мир, 2004. – С. 63-71, 79-83.

 

Тема № 3. Вивчення регуляції ферментативних процесів та аналіз механізмів виникнення ензимопатій. Дослідження ролі кофакторів та коферментних вітамінів у прояві каталітичної активності ферментів. Медична ензимологія.

Мета заняття. Засвоїти основні принципи регуляції метаболічних шляхів, порушення функціонування ферментів у клітині та використання ферментів у медицині. Засвоїти будову, загальні принципи класифікації та функціонування коферментних форм вітамінів.

Актуальність теми. Ферменти є біокаталізаторами з мінливою активністю, яка змінюється при певних регулюючих впливах. Водорозчинні вітаміни беруть участь в обміні речовин як коферменти і активатори багатьох ферментативних процесів. У клінічній практиці ферменти застосовують як фармпрепарати, а визначення їх активності у крові та сечі необхідно для діагностики патологічних станів.

Конкретні завдання.

Ø Аналізувати шляхи та механізми регуляції ферментативних процесів, як основи обміну речовин в організмі в нормі та при патологіях.

Ø Пояснювати застосування інгібіторів та активаторів ферментів як фармпрепаратів при порушеннях обміну речовин та певних патологіях.

Ø Пояснювати зміни перебігу ферментативних процесів та накопичення проміжних продуктів метаболізму при природжених (спадкових) та набутих вадах метаболізму – ензимопатіях.

Ø Вміти трактувати роль вітамінів та їх біологічно активних похідних в механізмах каталізу за участю основних класів ферментів.

Ø Класифікувати окремі групи коферментів за хімічною природою та типом реакції, яку вони каталізують.

 

Теоретичні питання

1. Активатори та інгібітори ферментів: приклади та механізми їх дії.

2. Типи інгібування ферментів: зворотне (конкурентне, неконкурентне) та незворотне.

3. Регуляція ферментативних процесів. Шляхи та механізми регуляції: алостеричні ферменти, ковалентна модифікація ферментів, протеолітична активація ферментів (обмежений протеоліз).

4. Циклічні нуклеотиди (цАМФ, цГМФ) як регулятори ферментативних реакцій і біологічних функцій клітини.

5. Класифікація коферментів за хімічною природою та типом реакції, яку вони каталізують.

6. Коферменти – переносники атомів водню та електронів (розглянути конкретні реакції): НАД⁺, НАДФ⁺ - коферменти – похідні вітаміну РР (нікотинаміду), ФАД, ФМН – коферменти – похідні вітаміну В₂ (рибофлавіну), роль вітаміну С в окисно-відновних реакціях, металопорфірини.

7. Коферменти – переносники хімічних груп (розглянути конкретні реакції): піридоксалеві коферменти, НS-КоА – коензим ацилювання, ліпоєва кислота, ТГФК – похідні фолієвої кислоти.

8. Коферменти ізомеризації, синтезу та розщеплення С – С зв’язків (розглянути конкретні реакції): тіаміндифосфат – похідне вітаміну В₁, карбоксибіотин – біологічно активна форма вітаміну Н, метилкобаламін та дезоксиаденозилкобаламін – похідні вітаміну В₁₂.

9. Ензимопатії – природжені (спадкові) вади метаболізму вуглеводів, амінокислот, порфіринів, пуринів.

10. Ензимодіагностика патологічних процесів і захворювань.

11. Ензимотерапія – застосування ферментів, їх активаторів та інгібіторів у медицині.

 

Практична робота