Лейкоцитарная формула здорового человека

Лейкоциты	Базофилы	Эозинофилы	Юные нейтрофилы	Палочкоядерные нейтрофилы	Сегментоядерные нейтрофилы	Лимфоциты	Моно­циты
4,0- 9,0х 10^9/л	0-1%	0,5-5 %	0-1%	1-6%	47-72%	19-37%	3-9%

Принцип: Микроскопия сухих фиксированных и окрашенных мазков крови с дифференцированием различных форм лейкоцитов.

Реактивы: 1.Иммерсионное масло

2.70% спирт

Специальное оборудование:

1.Микроскоп

2.11- Клавишный счетчик для подсчета лейкоцитарной формулы или счетные машинки СЛ-1

 

Ход исследования

Подсчет лейкоцитарной формулы проводят с помощью иммерсионной системы микроскопа. В связи с тем, что мазке различные виды лейкоцитов располагаются неравномерно (моноциты и нейтрофилы — преимущественно вдоль верхнего и нижнего продольного края препарата, лимфоциты — ближе к его центру), подсчет лейкоцитарной формулы осуществляют, пользуясь следующими методическими указаниями. Под малым увеличением микроскопа находят край мазка крови вблизи образовавшей щеточки. У продольного края мазка наносят каплю иммерсионного масла, после чего фокусируют плоскость препарата. Наблюдая в окуляр, отступают на 2—3 поля зрения по направлению к середине мазка. Затем продолжают продвижение препарата в том же направлении на 3—5 полей зрения, в каждом из них подсчитывая имеющиеся лейкоциты. Вслед за этим продвигают мазок 3—5 полей зрения вдоль продольного края, меняя правление продвижения мазка под прямым углом, возвращаются к краю мазка, продвигая при этом мазок еще 3—5 полей зрения и так далее. Зигзагообразную линию, по которой продвигают мазок крови, называют линией Меандра:

 

Подсчет продолжают до тех пор, пока не будет сосчитано 50 % клеток. Затем подсчет продолжают на противоположной стороне мазка, т. е 50 лейкоцитов вверху и 50 лейкоцитов внизу. Так же, как описано выше, при про­тяжении мазка подсчитывают все лейкоциты, обнаруживаемые в поле зрения. Подсчет заканчивают, когда сумма лейкоцитов будет равна 100. Регистрацию лейкоцитов при подсчете производят с помощью счетчика II клавишного СЛ-1, при этом получают общую сумму и количество каждого вида лейкоцитов в процентах. При отсутствии счетчика регистрацию производят с помощью записи на листе бумаги. По вертикали записывают начальные буквы названий лейкоцитов: метамиелоциты (мтмц.), палочкоядерные (п.), сегментоядерные (с.), эозинофильные (э.), базофильные гранулоциты (б.), лимфоциты (лимф.), моноциты (мон.), плазматические клетки (мл.). По мере подсчета лейкоцитарной формулы каждый найденный лейкоцит регистрируют палочкой или точкой, которую ставят в горизонтальном ряду, соответствующем тому или иному виду лейкоцитов. Для облегчения последующего подсчета каждого вида лейкоцитов палочки или точки группируются десятками:

Процентное содержание различных видов лейкоцитов не отражает истинного количества их в 1 л крови, поэтому вычисляют абсолютное содержание лейкоцитов в 1 л крови.. Для этого необходимо знать количество лейкоцитов в I л крови, процентное содержание отдельных их видов, подсчитанных в окрашенном препарате. Абсолютное содержание отдельных видов лейкоцитов в 1 л крови высчитывают, пользуясь следующей пропорцией: а — 100 %, х-б, где а — количество лейкоцитов, подсчитанных в камереГоряева; б — процентное содержание лейкоцитов подсчитанных в мазке крови. Допустим, что количество лейкоцитов, подсчитанных в камере Горяева, составляет 8х 10⁹/л, а количество моноцитов, посчитанных в мазке крови, — 4%. Абсолютное количество моноцитов будет равно:

 

8х 10⁹/л-100 %

8х 10⁹/л х 4 = 0,32 х10⁹/л экземпляров

Х - 4%, х= 100

 

 

Морфологические структурные изменения лейкоцитов

при патологии

 

Структурные изменения в лейкоцитах (токсикогенная зернистость, вакуолизация, пикноз; хроматинолиз, кариорексис, цитолиз) выявляют в окрашенных препаратах крови; некоторые из них могут быть выявлены только в цитоплазме или только в ядре клеток; нередки сочетания различный структурных изменений в лейкоцитах.

Включения Князькова — Деле — крупные голубого цвета комочки, имеющие различную форму и находящиеся в цитоплазму нейтрофильных гранулоцитов.

Тельца Амато — образования округлой формы или в виде запятой, бледно-голубого цвета, содержащие красные или красно-фиолетовые гранулы.

Истощение зернистости проявляется либо уменьшением, либо ее полным исчезновением, что наиболее часто наблюдают в цитоплазме нейтрофильных гранулоцитов, исходящих из воспалительного очага костногоо мозга при его токсическом поражении, леченном хроническом миелоидном лейкозе.

Несоответствие степени созреванияядра и цитоплазмы — может быть выявлено «молодое» ядро в созревшей цитоплазме и, наоборот, зрелое ядро и базофильная цитоплазма в нейтрофильных гранулоцитах, что наблюдают, например, при хроническом миелоидном лейкозе.

Вакуолизация цитоплазмы и ядра в виде небольшого размера бесцветных пятен, количество которых варьирует от единичных до множественных и часто округленных (в нейтрофильных гранулоцитах) гранул.

Пикноз ядра выявляется в виде уплотненного, интенсивно окрашенного базихроматина; ядро или участок ядра уменьшается в размере, становится бесструктурным.

Гиперсегментация ядра — количество сегментов в ядре клетки варьирует от 6 до 10 и более. Помимо мегалобластных анемий, гиперсегментацию выявляют после воздействия химических веществ, проникающего ионизирующего излучения.

Фрагментоз — от участков основного ядра отделяются фрагменты, связанные с ним тонкой нитью базихроматина. Количество фрагментов варьирует от единичных до множественных.

Гипохроматоз — в связи с изменением физико-химической структуры хроматин не окрашивается, остается светлым; контуры ядерной оболочки не выявляются.

Хроматинолиз — в связи с раз­рушением хроматина весь массив ядра или его участок не окрашивается, остается светлым; контуры ядерной оболочки четкие.

Кариорексис —распад ядра на отдель­ные частицы, не связанные между собой; частицы имеют округлую форму, разную величину, большей частью плот­ные, интенсивно окрашенные (пикнотичные).

Кариолиз — разрушение ядра. Обычно на месте ядра или разрушен­ного его участка остается бесструктурное образование.

Анизоцитоз — появление небольших, крупных и гигант­ских клеточных элементов, что наиболее характерно для нейтрофильных гранулоцитов. Лейколиз — разрушение лейкоцита. Термин часто используют для описания раз­рушенных лимфоцитов при хроническом лимфоидном лейкозе.

Цитолиз — разрушение клетки с образо­ванием бесструктурной, бесформенной массы.

Перечисленные выше структурные изменения в лейкоцитах наблюдают при воспалительных (особенно септических) состояниях, некоторых инфекционных и паразитарных заболеваниях, лейкозах, анемиях и т.д.

 

 

Раздел III

Дополнительные гематологические исследования

Тромбоциты

 

3.1.1 Методика окраски мазков крови на тромбоциты по Алексееву (подсчет по Фонио)

 

Принцип: Метод основан на подсчете числа тромбоцитов в окрашенных мазках крови на 1000 эритроцитов с расчетом |на 1 мкл (или 1 л) крови, исходя из содержания в этом объеме количества эритроцитов.

Реактив: рабочий раствор краски по Алексееву

Оборудование: микроскоп

Ход определения: В капилляр для определения СОЭ набирают рабочий раствор до метки 0,75 мкл, и полный капилляр крови из прокола пальца больного. Соотношение красителя к крови составляет 1:4. Смесь оставляют на 2 часа, затем делают тонкий мазок на предметном стекле. Мазок высушивают на воздухе и микроскопируют с иммерсией.

Подсчет производят следующим образом: в каждом поле зрения микроскопа считают число эритроцитов и тромбоцитов, передвигая мазок до тех пор, пока не будут просчитаны 1000 эритроцитов. Для удобства счета и большей точности следует пользоваться специальным окуляром или подбирают поле зрения, в котором имеется, например 50 эритроцитов, и просчитывают 20 полей.

 

РАСЧЕТ: Х=А х В / 1000

Пример: На 1000 эритроцитов подсчитано 70 тромбоцитов, а количество эритроцитов в 1 л крови (в камере Горяева) составило 4,2;

 

70 х 4,2 х 10 12 = 294 х 10 9 /л или 294 тыс.

Нормативные величины: 180-320 х 10 9 (или от 180-320 тыс.)

 

Клинико-диагностическое значение:

Тромбоцитопения - снижение тромбоцитов в крови ниже нормы важный симптом геморрагического диатеза, так же при острых лейкозах, циррозе печени, ионизирующем облучении, системной красной волчанке, апластических анемиях, тяжелой железодефицитной анемии и т.д. При количестве тромбоцитов ниже 60х 10 9/л появляются симптомы кровоточивости.

Тромбоцитоз - повышение количества тромбоцитов в крови, важный симптом при злокачественных новообразованиях. Может наблюдаться при – воспалительных процессах (острый ревматизм, туберкулез, язвенный колит), острой кровопотери и т.д.

3.1.2 Методика определения длительности кровотечения (уколочная проба по Дуке)

Наносят более глубокий, чем обычно укол в палец (3 мм). Включают секундомер. Через 30 сек с полоской фильтровальной бумаги прикасаются к капле крови (1-ую каплю не снимают!). Постепенно капли крови на бумаге становятся все меньше и меньше и в конце концов исчезают.

Нормативная величина: В норме кровотечение составляет от 2-3-5 мин

3 .1.3 Методика определения времени свертывания капиллярной крови (метод Сухарева)

 

Кровь берут из пальца в чистый и сухой капилляр от аппарата Панченкова. Первая капля крови содержит примесь тканевой жидкости и для исследования не пригодна. В капилляр набирают столбик крови высотой 25-30 мм и переводят ее в середину капиллярной трубки. Включают секундомер и через каждые 30 сек, наклоняют капилляр вправо и влево под углом 30-45 градусов. Кровь свободно перемещается внутри капилляра. С началом свертывания ее движение замедляется. В момент полного свертывания кровь перестает двигаться. По секундомеру отмечают моменты начала и конца свертывания.

 

Клинико-диагностическое значение: Начало свертывания в норме наступает в период от 30 до 2 мин, конец от З. до 5 мин.

 

Ретикулоциты

Ретикулоциты — молодые эритроциты, обра­зующиеся после потери нормобластами ядер. Характерной особенностью ретикулоцитов явля­ется наличие в цитоплазме зернисто-нитчатой субстанции, представляющей агрегированные рибосомы и митохондрии. Эта субстанция выяв­ляется при специальном методе окраски — суправитальном (прижизненная), т. е. без предварительной фикса­ции клеток. Зернисто-нитчатая субстанция в различных ретикулоцитах отличается полимор­физмом; чем клетка моложе, тем субстанция более обильная. У самых молодых ретикуло­цитов она имеет форму густого клубка, у более зрелых клеток выявляется в виде сеточки, от­дельных нитей и затем отдельных зерен. В маз­ках, окрашенных обычными гематологическими методами, ретикулоциты серовато-розового цве­та — полихроматофильны, т. е. окрашены раз­ными красителями.

Определение количества ретикулоцитов про­изводится при микроскопии специально окра­шенных мазков

 

3.2.1 Методика окраски мазков крови на ретикулоциты по Алексееву (подсчет по Фонио)

Принцип: Метод основан на подсчете числа ретикулоцитов в окрашенных мазках крови на 1000 эритроцитов. Готовят одновременно 2 мазка (на тромбоциты и ретикулоциты).

Реактив: рабочий раствор краски по Алексееву

Оборудование: микроскоп

Ход определения: В капилляр для определения СОЭ набирают рабочий раствор до метки 0,75 мкл, и полный капилляр крови из прокола пальца больного. Соотношение красителя к крови составляет 1:4. Смесь оставляют на 2 часа, затем делают тонкий мазок на предметном стекле. Мазок высушивают на воздухе и микроскопируют с иммерсией.

Подсчет производят следующим образом: сетки ретикулоцитов окрашиваются в синий цвет. Во время подсчета эритроцитов в поле зрения считают количество ретикулоцитов. Подсчитывают 1000 эритроцитов. Результат выражают в процентах.

Нормативная величина: В крови здорового человека содержится 0,2-1,0 %

(или 2-10 даже допускается до 12 проммиль) ретикулоцитов

Клинико-диагностическое значение: Появление ретикулоцитов в периферической крови указывает на усиленную работу костного мозга и используется при оценке различных видов анемий.

Повышение количества ретикулоцитов наблюдается после кровопотери, при гемолитических анемиях

Резкий ретикулоцитоз - отмечается при гемолитической желтухе

Снижение количества ретикулоцитов при наличии анемии говорит об апластическом типе кроветворения.

По уровню ретикулоцитов в крови анемии подразделяются на:

- регенераторные (количество ретикулоцитов 0,5-5 %- это постгеморрагические анемии);

- гиперрегенераторные (количество ретикулоцитов более 5% - это гемолитические анемии);

- гипо - и арегенераторные (количество ретикулоцитов снижено или они отсутствуют, несмотря на тяжелое течение анемии- гипо - и апластические, железо- и. В 12- дефицитные анемии).

Внимание! Ретикулоцитоз при отсутствии анемии указывает на скрытые, но хорошо компенсированные кровопотери.

 

Объем эритроцитов

Гематокритная величина, или показатель гематокрита, дает представление о соотношении между объемами плазмы и форменных элементах крови (главным образом эритроцитов), по­рученном после центрифугирования крови. Принятой гематокритной величиной выражать объем эритроцитов. В качестве унифицированных ме­тодов определения гематокритной величины (гематокрита) утверждены два метода: с помощью микроцентрифуги и микрометод в модификации Тодорова

 

3.3.1 Унифицированный метод с помощью микроцентрифуги.

Принцип. Центрифугирование крови определенное время при постоянном числе оборотов центрифуги с последующим определением результата по специальной шкале.

Реактивы. Антикоагулянты: гепарин — ЕД/мл разводят дистиллированной водой соотношении 1: 5 или этилендиаминтетрауксусной кислоты динатриевая соль (ЭДТА Na₂, трилон Б), 40 г/л.

Оборудование. 1. Микроцентрифуга ШГ-8. 2. Капиллярные трубки (в комплекте

Ход определения. Предварительно обработанный антикоагулянтом и высушенный капилляр заполняют кровью из пальца (или венозной) на ⁷/в длины. Укупоривают капилляр с одного конца специальной пастой (можно пластилином). Помещают в ротор центрифуги, чтобы укупоренные концы упирались в резиновую прокладку, и центрифугируют 5 мин 8000 об/мин. По отсчетной шкале, приложенной к центрифуге МЦГ-8, определяют гематокритную величину.

 

3..3..2Унифицированный микрометод (модификации. Тодорова).

 

Принцип. Центрифугирование крови определенное время при постоянном числе оборотов центрифуги с после­дующим определением результата по градуиро­ванным капиллярам.

Реактивы те же.

Оборудование. 1. Центрифуга. 2. Пи­петки от аппарата Панченкова (с отрезанным верхним концом и длиной 10—11 см).

Ход определения. В обработанную антикоагулянтом и высохшую пипетку набирают кровь из пальца (или венозную) до верхней мет­ки (100 делений). Пипетку укупоривают, обтя­гивая ее резиновым кольцом, и центрифугируют 30—40 мин при 3000 об/мин. Результат отме­чают по градуировке капилляра, вычитая из 100 высоту столбика эритроцитов.

Нормальные величины. У здоро­вых гематокрит венозной и капиллярной крови равен 40—48 % (или 0,40—0,48) для мужчин и 36—42 % (или 0,36—0,42) для женщин.

Клиническое значение. Показа­тель широко используют для суждения о степени анемии, при которой, как правило, отмечается его снижение, иногда до значительных цифр (20—25 %). Выраженное повышение (55—65 %) характерно для эритремии, менее резкое увели­чение (50—55 %) наблюдается при симптома­тических эритроцитозах, сопутствующих вро­жденным порокам сердца, легочной недостаточ­ности, некоторым гемоглобинопатиям. Показа­тель гематокрита дает представление о гемокон-центрационных сдвигах, он снижается при гемодилюции. Используют гематокрит для расчетных показателей, отражающих различные характе­ристики эритроцитов: средний объем, средняя концентрация гемоглобина, а также для ряда биохимических показателей.

 

3.4 Осмотическая резистентность

Осмотическая резистентность (стойкость) - это устойчивость эритроцитов по отношению к гипотоническим растворам солей. В растворе с осмотическим давлением, равным осмотическому давлению крови, эритроциты не изменяются. Изотоническим раствором является раствор хлорида натрия в концентрации 0,85-0,9%. При перемещении эритроцитов в раствор с меньшей концентрации - гипотонический раствор, они набухают и гемолизируются. В гипертоническом растворе эритроциты сморщиваются, т. к вода из их выходит в раствор с большим осмотическим давлением. На этих свойствах эритроцитов основано определение их осмотической резистентности. Степень гемолиза их измеряется в гипотонических растворах хлорида натрия определенной концентрации.

3.4.1Унифицированный метод определения осмотической резистентности эритроцитов в модификации Идельсона

Принцип: Количественное определение степени гемолиза эритроцитов в за буферных гипотонических растворах хлорида натрия.

Реактив: основной раствор (27,31 г двузамещенного фосфата натрия Na;HPO<, 4,86 г однозамещенного фос­фата натрия NaH₂P04-2H₂0, 180 г хлорида натрия в 2 л дистиллированной воды); РН раствора 7,4.

По своей осмотической концентрации основной ра­створ соответствует 10% раствору хлорида натрия. Его разводят в 10 раз, получая рабочий раствор, осмотическая концентрация которого соответствует 1% раствору хлори­да натрия. Из рабочего раствора готовят разведения хлорида натрия следующих концентраций: 0,85; 0,75; 0,70; 0,65: 0,60; 0,55; 0,50; 0,45; 0,40; 0,35; 0,30; 0,20 и 0,10%. Можно готовить сразу по 100 мл этих растворов и хранить течение 2 нед в холодильнике.

Ход определения. В 2 стерильные пробирки, со­держащие по 2 капли гепарина, берут по 1,5 мл крови. 1-ю пробирку помещают на сутки в термостат, 2-ю — используют в день взятия крови.

В 14 центрифужных пробирок разливают по 5,0 мл приготовленных растворов с последовательно понижа­вшейся концентрацией. В 1-ю пробирку помещают 5,0 мл рабочего раствора с концентрацией 1%. В каждую пробир­ку прибавляют по 0,02 мл гепаринизированной крови, перемешивают и оставляют на 30 мин при комнатной температуре (20° С). Центрифугируют при 2000 об/мин в течение 5 мин. Надосадочную жидкость из каждой про­бирки сливают в чистую пробирку с соответствующим номером.

Фотометрируют на ФЭКе при длине волны 500—560 нм (зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 10 мм против в холостой пробы.

Холостая проба – надосадочная жидкость в пробирке, содержащей 1 % раствор хлорида натрия.

Расчет. За 100% гемолиз принимают гемолиз в пробирке, содержащей 0,1 % раствор хлорида натрия. Вычисляют процент гемолиза в каждой пробирке, сравнивая величины экстинкции надосадочной жидкости с экстинкцией, при­нятой за 100 %, по формуле:

Ех х 100

Е1

 

где Е1) — экстинкция надосадочной жидкости в пробирке с 0,1 % раствором хлорида натрия; Е_х — экстинкция исследуемой пробы; 100 — про­цент гемолиза в пробирке с 0,1 % раствором хло­рида натрия.

На следующий день повторяют исследование с кровью, инкубированной 24 ч при 37 °С.

Нормальные величины. У здоро­вых в свежей крови начало гемолиза отмечают при концентрации хлорида натрия 0,48—0,46%, а полный гемолиз — при 0,34—0,32% растворе хлорида натрия.

Клиническое значение. Исследо­вание проводят при подозрении на гемолити­ческую анемию. Понижение осмотической ре­зистентности, т. е. появление гемолиза эритроци­тов при более высокой, чем в норме, концентра­ции хлорида натрия (0,70—0,75 %), наблюда­ется при наследственном микросфероцитозе и некоторых наследственных несфероцитарных ге­молитических анемиях, а также иногда при ауто­иммунной гемолитической анемии. В ряде случа­ев понижение осмотической резистентности вы­является только при исследовании инкубирован­ной крови. Повышение осмотической резистент­ности характерно для талассемии.

Раздел I V