Основні принципи визначення активності ферментів у сироватці крові. Одиниці активності ферментів. Недоліки ферментного аналізу

 

Ферменти, як і всі білки, є відносно нестійкими речовинами. Вони легко піддаються денатурації й інактивації, тому, працюючи з ферментами (ферментативні набори для визначення субстратів або активності ферментів, зразки біологічного матеріалу, що містять ферменти), слід дотримуватися загальних правил.

1. Не можна сильно струшувати розчини ферментів і допускати утворення піни при їх перемішуванні, оскільки ферменти при цьому можуть інактивуватися в результаті дії на них кисню повітря.

2. Розчинені, ліофільно висушені реагенти, контрольні матеріали й контрольні сироватки, що містять ферменти, перед використанням необхідно витримати при кімнатній температурі впродовж часу, зазначеного в інструкції, щоб фермент набув конформаційно активного стану. Необхідно суворо дотримуватися умов ферментативної реакції (час і температура інкубації, співвідношення реагент/сироватка).

3. Час початку й закінчення ферментативної реакції слід фіксувати для кожної окремої проби. Початком реакції вважається момент додавання в реакційну суміш сироватки крові, а також реагенту, який дає кольорову реакцію, якщо реакція двостадійна. Для кінетичних методів, коли аналіз у декількох пробах проводять послідовно, час початку реакції та рівні проміжки часу між фотометруваннями слід точно фіксувати за секундоміром для кожної окремої проби. Оскільки визначення, як правило, проводять у декількох пробах, сироватку в реакційну суміш у паралельних пробах слід вносити через чітко фіксовані за секундоміром проміжки часу, наприклад, через 30 с або 1 хв. Початком реакції вважається внесення сироватки в першу пробу із серії. Після закінчення часу реакції слід із таким самим інтервалом зупиняти реакцію в паралельних пробах, тобто вносити реагент, наприклад луг, з інтервалом 30 с або 1 хв відповідно. Таким чином, час реакції буде фіксований для кожної окремої проби. Винятком із цього правила можуть бути лише методи, в яких час ферментативної реакції становить 1 год, тоді припущене відхилення в часі між пробами, які визначають паралельно, матиме незначний вплив на кінцевий результат.

4. Перед початком ферментативної реакції температуру робочого реагенту необхідно довести до значення, зазначеного в інструкції, і забезпечити підтримання цієї температури впродовж усього часу аналізу. Часто для цього використовують водяну баню.

5. Не можна змінювати співвідношення робочий реагент/сироватка кров, а також розбавляти робочий реагент із метою економії, оскільки при цьому умови реакції (концентрація буфера, активаторів і т. д.) відхиляться від оптимальних, що призведе до змін результатів аналізу як у разі визначення активності ферментів, так і у разі визначення аналітів ферментативними методами.

6. Якщо концентрація ферменту або іншого аналіту в біологічній рідині перевищує верхню межу концентрації, яка може бути визначена за допомогою даного набору, то досліджувану пробу необхідно розбавити точно відповідно до рекомендацій, викладених у інструкції до набору. Для отримання точних і відтворюваних результатів іноді пробу взагалі не рекомендується розбавляти, оскільки активність деяких ферментів, наприклад АлАТ і АсАТ, непропорційно зменшується при розбавленні. Однак не завжди лінійна область визначення набору дозволяє охопити весь діапазон лінійних концентрацій речовини, яку визначають. Тоді необхідно намагатися розбавляти пробу мінімально, бажано в 2–3 рази (особливо при визначенні активності ферментів) і не більше, ніж зазначено в інструкції. Зрозуміло, для розведення не можна використовувати маленькі аліквоти (10–20 мкл); щоб зменшити помилку розведення, краще взяти хоча б 100 мкл проби.

7. Фотометрування слід проводити у зазначеному в інструкції діапазоні довжин хвиль та кюветі з певною довжиною оптичного шляху.

8. При побудові калібрувальних графіків необхідно робити не менше 4–5 паралельних визначень кожного стандартного зразка зазначеної в інструкції концентрації. Будувати калібрувальну криву слід для кожної серії набору, а також при зміні фотометричного обладнання.

9. Калібрувальну пробу, що використовується для розрахунку активності ферменту, необхідно ставити для кожної серії аналізів у чотирьох паралелях.

10. Для миття посуду можна використовувати тільки мийні засоби, що не містять біодобавки, оскільки до їх складу входять протеази, які навіть у слідових кількостях можуть зруйнувати ферменти в реакційній суміші.

11. Необхідно стежити за якістю дистильованої води, що використовується в процесі аналізу. Надлишок деяких іонів, що входять до її складу, може інгібувати ферменти.

12. Для отримання достовірних результатів дуже важливим є преаналітичний етап. На цьому етапі велике значення мають процедура взяття крові в пацієнта, транспортування в лабораторію, пробопідготовка та зберігання проби до аналізу. Невміле взяття крові може призвести до помилкових результатів. Як приклад можна навести такі чинники долабораторного етапу, які можуть істотно вплинути на результати визначення активності ферментів. Так, тривалий венозний стаз може призвести до гіпоксії та збільшення проникності мембран клітин крові, що позначиться на активності ряду ферментів. Інший негативний чинник – гемоліз; при тривалому стоянні крові активні радикали кисню та дефіцит субстратів призводять до ушкодження мембран еритроцитів. Гемоліз, вивільнення ферментів із лейкоцитів і тромбоцитів можуть помітно вплинути на активність ЛДГ, АсАТ, АлАТ, кислої фосфатази в сироватці крові. ЛДГ і кисла фосфатаза наявні у високих концентраціях у тромбоцитах, тому активність цих ферментів у сироватці вища, ніж у плазмі. При згортанні крові в сироватці з’являються ферменти з тромбоцитів, зокрема кисла фосфатаза, тому при роботі з сироваткою рекомендується щонайшвидше відділити її від згустка. Механічні ушкодження клітин крові (наприклад, унаслідок випускання крові зі шприца в пробірку під тиском або інтенсивного струшування при перемішуванні) також можуть позначитися на результатах визначення активності ферментів. Зберігання сироватки також несприятливо позначається на результатах визначення активності багатьох ферментів (вони занижуються), тому слід вимірювати активність ферментів у сироватці в день узяття крові в пацієнта. Тривале зберігання крові приводить до активації протеолізу.

13. Слід точно дотримуватися умов зберігання ферментативних наборів і їх компонентів, оскільки ферменти – термолабільні каталізатори. Так, амілаза, ліпаза, ЛАП, ГГТП, ХЕ, кисла фосфатаза стійкі при зберіганні, стабільність інших ферментів варіює. Багато ферментів можна зберігати в замороженому стані і у вигляді ліофілізатів без втрати активності, проте деякі ферменти чутливі до процедури заморожування, їх можна заморожувати тільки після додавання стабілізаторів. Це пов’язано з тим, що вода при кристалізації викликає незворотні зміни у водневих зв’язках білка. Наприклад, уреаза при заморожуванні частково або повністю інактивується. Особливо чутливі до процедури заморожування ферменти, що складаються з декількох субодиниць. Не допускається при зберіганні кілька разів заморожувати та розморожувати проби.

14. Слід регулярно перевіряти правильність і відтворюваність результатів аналізу з контрольних сироваток, які атестовані відповідними методами.

При оцінці отриманих результатів необхідно враховувати фізіологічні коливання активності ферментів. Так, існують деякі вікові відмінності у ферментних показниках. У новонароджених та у ранньому дитячому віці активність більшості ферментів дещо вища, ніж у дорослих. У людей похилого віку активність АсАТ, АлАТ, МДГ та деяких інших ферментів характеризується більш високими показниками. Емоційне навантаження, м’язова робота викликають невеликі зсуви активності ферментів. Так, у нетренованих людей тривале фізичне навантаження приводить до помітного коливання активності АсАТ, ЛДГ, МДГ, альдолази і особливо КК. Вагітність також виявляє певний вплив на активність ряду ферментів: у останні тижні відзначається невелике підвищення АсАТ, КК і ЛДГ. Арилсульфатаза, ЛАП, β-глюкуронідаза і гістаміназа при вагітності також змінюють свою активність, яка нормалізується через декілька днів після пологів.

Крім того, ферментні показники можуть зазнавати індивідуальних коливань, що пов’язані з генетичними особливостями, характером харчування, професією, способом життя людини та ін.

Під кількістю ферменту розуміють концентрацію специфічного білка, а під активністю – його здатність прискорювати перебіг біохімічної реакції. Для більшості ферментів з визначеної активності можна судити і про їх кількість. Але є й такі ферменти, специфічні зміни яких відображає лише масова концентрація, наприклад, креатинкіназа та її ізофермент MB.

Комісія з ферментів Міжнародного біохімічного союзу встановила, що одиницю каталітичної активності ферменту можна визначити як кількість ферменту, що каталізує перетворення 1 мкмоль субстрату за 1 хв за оптимальних умов. Ця одиниця називається міжнародною одиницею, MО, або IU (International Unit). У системі СІ одиницею каталітичної активності ферменту є катал (кат), який відповідає кількості ферменту, що перетворює 1 моль субстрату за 1 с при оптимальних умовах. При цьому об’ємна активність ферменту виражається як МО/л або кат/л, або кат/м³ і має назву концентрації каталітичної активності, або каталітичної концентрації, на відміну від питомої активності, яка виражається в МО/мг білка. У разі визначення масової концентрації ферменту, наприклад, креатинкінази MB, її виражають у мкг/л, використовуючи імунохімічні методи (радіоімунологічний аналіз або імуноензимометричні тести).

Активність ферментів in vivo та in vitro залежить не тільки від їх концентрації, але також від наявності активаторів та інгібіторів. Деякі чинники, пов’язані з проведенням аналізів, можуть впливати in vitro на активність ферменту. Тому в різних лабораторіях можуть бути одержані різні результати під час вимірювань активності одного й того ж ферменту в однакових, здавалося б, одиницях. Подібним же чином у різних лабораторіях можуть надавати різного діагностичного значення кількісним співвідношенням активності одного ферменту до такої іншого. Важливими чинниками вважають природу використаних субстратів, буферних розчинів і температуру проб. Оскільки у визначенні «міжнародних одиниць» ці чинники не враховуються, результати, одержані в різних лабораторіях і виражені в однакових, здавалося б, одиницях, можуть бути безпосередньо незіставними. Тому при інтерпретації результатів визначення активності ферментів їх необхідно порівнювати з одержаними в цій самій лабораторії даними про діапазон нормальних варіацій.

Тестові завдання для контролю засвоєння матеріалу