В клініко-лабораторній діагностиці

 

До недавнього часу ферменти були лише об’єктом дослідження в клінічній біохімії, і лише порівняно недавно вони стали використовуватися як аналітичні реагенти, тобто як реактиви для кількісного визначення інших речовин.

Переваги ферментативних методів дослідження: висока точність, специфічність, чутливість. До цього слід додати простоту проведення аналізу, значне скорочення часу дослідження і часто відсутність необхідності побудови калібрувальних графіків.

Використання ферментів як аналітичних реагентів почалося із так званого оптичного тесту Варбурга. Цей тест ґрунтується на тому, що відновлені форми нікотинамідаденіндинуклеотидів (НАДН+Н⁺ і НАДФН+Н⁺) мають виражений максимум поглинання в ультрафіолетовій області при 340 нм, тоді як їх окиснені форми (НАД⁺ і НАДФ⁺) цього максимуму не мають. Це дозволяє стежити за ходом ферментативної реакції за збільшенням або зменшенням величини оптичної густини при 340 нм, тобто за збільшенням або зменшенням вмісту НАДН+Н⁺ (або НАДФН+Н⁺) в аналізованому зразку. Простим прикладом використання оптичного тесту Варбурга є реакція, що каталізується ЛДГ:

піруват + НАДН+Н⁺ ---> лактат + НАД⁺

На рис. 3 наведена зміна оптичної густини при довжині хвилі 340 нм у ході цієї реакції.

Оскільки в процесі окиснення пірувату кількість НАДН+Н⁺ знижується, величина оптичної густини також знижується, і це зниження продовжується до того часу, поки весь піруват, що є в пробі, не вступить у реакцію. Цей момент відповідає виходу кривої на графіку на плато. Оскільки піруват і НАДН+Н⁺ вступають у реакцію в еквімолярних кількостях, то зменшення НАДН+Н⁺ дорівнює кількості пірувату, що міститься в аналізованому зразку.

 

Рисунок 3 – Зміна оптичної густини у ході лактатдегідрогеназної реакції

 

Аналогічним чином може проводитися кількісне визначення всіх речовин, що є субстратами дегідрогеназ (малат, лактат, сукцинат і т. д.).

Розглянута вище ЛДГ-реакція може бути індикаторною при визначенні активності АлАТ. У цій спряженій системі реакції відбуваються за схемою

АлАТ

α-аланін + α-кетоглутарат--------> піруват + α-глутамат,

ЛДГ

піруват + НАДН+Н⁺ ---------> лактат + НАД⁺.

 

Реакція супроводжується зниженням величини оптичної густини при 340 нм, швидкість якого пропорційна активності АлАТ. Аналогічним чином може бути визначена активність АсАТ, але індикаторним ферментом у цьому випадку буде малатдегідрогеназа.

На використанні глюкозо-6-фосфатдегідрогенази (Г6ФДГ) як індикаторного ферменту базується найточніший метод із усіх існуючих методів визначення концентрації глюкози. Тут реакція відбувається за схемою

гексокіназа

глюкоза + АТФ ---------------> глюкозо-6-фосфат + АДФ

Г6ФДГ

глюкозо-6-фосфат + НАДФ⁺ ----------> 6-фосфоглюконат + + НАДФН+Н⁺.

Глюкоза за участі гексокінази фосфорилюється до глюкозо-6-фосфату, який за допомогою Г6ФДГ окиснюється до 6-фосфоглюконової кислоти. Ця реакція супроводжується накопиченням НАДФН+Н⁺ і, отже, зростанням оптичної густини при 340 нм.

Інший підхід до визначення глюкози базується на використанні спряженої системи глюкозооксидаза + + пероксидаза й більш широко відомий. За участі глюкозооксидази глюкоза окиснюється киснем повітря з утворенням перекису водню, кількість якого визначається за його здатністю за наявності пероксидази окиснювати діаміни з утворенням забарвлених продуктів:

глюкозооксидаза

глюкоза + О₂ + Н₂О -------------> глюконова кислота + Н₂О_2,

пероксидаза

Н₂О₂ + барвник ---------------> забарвлений продукт + Н₂О.

Як барвники (індикатори) для пероксидазної реакції запропоновано цілу групу речовин: о-толуїдин, о-діанізидин, фенол+4-аміно-антипірин та ін.

Вважають, що реакція з 4-аміно-антипірином має перевагу, оскільки забарвлення, що розвивається, більш стабільне, ніж при використанні інших речовин.

Ця сама пероксидазна реакція за участі 4-аміно-антипірину, запропонована Тріндером, може бути використана для кількісного визначення холестеролу й тригліцеридів.

При визначенні холестеролу його ефіри гідролізуются холестеролестеразою до вільних жирних кислот і холестеролу, який під впливом холестеролоксидази окиснюється киснем повітря до ∆⁴-холестенону. Перекис водню, що утворюється при цьому, за наявності пероксидази окиснює речовини-індикатори з утворенням забарвлених сполук, інтенсивність забарвлення яких пропорційна вмісту холестеролу в досліджуваному зразку:

холестеролестераза

ефіри холестеролу ------------------> холестерол + R-COOH,

холестеролоксидаза

холестерол + O₂ ----------------------> ∆⁴-холестенон + H₂O₂,

пероксидаза

2H₂O₂ + 4-аміно-антипірин + фенол -----> забарвлений продукт + 4H₂O₂.

 

Описаний метод визначення холестеролу є найточнішим серед існуючих. У реакції Лібермана-Бурхарда, рутинному методі визначення холестеролу, беруть участь й інші стероли, що призводить до завищених результатів. До інших переваг ферментативного методу необхідно віднести відсутність впливу домішок білірубіну й гемоглобіну, необхідності проводити тривалий гідроліз ефірів і екстракцію холестеролу, відсутність агресивних реагентів.

Ще складніша ферментна система може бути використана для визначення тригліцеридів. Тригліцериди розщеплюються ліпазою до жирних кислот і гліцеролу, який за участі гліцерокінази й АТФ фосфорилюється з утворенням гліцерол-3-фосфату. Гліцерол-3-фосфат за наявності гліцерофосфатоксидази окиснюється киснем повітря з утворенням фосфодіоксіацетону й перекису водню, який, у свою чергу, окиснює барвник із утворенням забарвленого комплексу, інтенсивність забарвлення якого пропорційна концентрації тригліцеридів у досліджуваному зразку.

ліпаза

тригліцерид + 3H₂O ---------> гліцерол + 3R-COOH,

гліцерокіназа

гліцерин + АТФ -----------> гліцерол-3фосфат + АДФ,

гліцеролфосфатоксидаза

гліцерол-3фосфат + O₂ -------> фосфодіоксіацетон + H₂O_2,

пероксидаза

H₂O₂ + 4-аміно-антипірин + 4-хлорфенол -----------> забарвлений комплекс + 2H₂O + HCl.

 

Цей метод визначення тригліцеридів найбільш специфічний, виключно точний і надзвичайно простий у виконанні.

На цей час розроблена ціла група ферментативних методів визначення сечової кислоти. Першим етапом цих методів є розщеплення сечової кислоти уриказою до алантоїну, вуглекислоти й перекису водню:

уриказа

сечова кислота + 2H₂O + O₂ ------> алантоїн + CO₂ + H₂O₂.

 

Пероксид водню, що утворився, може бути визначений різними способами:

- за реакцією з 4-аміно-антипірином або іншим аналогічним барвником;

- перетворенням метанолу за участі каталази у формальдегід, який визначається спеціальними методами;

- окисненням перекисом етанолу в ацетатальдегід, який потім відновлюється НАДН (оптичний тест Варбурга).

Слід відзначити високу специфічність усіх ферментативних методів визначення сечової кислоти порівняно з рутинними фосфорно-вольфрамовими методами, оскільки, крім сечової кислоти, фосфорно-вольфрамову кислоту відновлюють аскорбінова кислота, тирозин, триптофан, цистин, цистеїн та ін.

Ще більшу кількість методів запропоновано для ферментативного визначення сечовини. Першим етапом усіх цих методів є розщеплення сечовини уреазою до аміаку та вуглекислоти:

уреаза

сечовина + Н₂O ----------> 2NН₄⁺ + CО₂.

Визначення іонів амонію може бути здійснене різними способами:

- класичною бертолетовою реакцією;

- модифікованою бертолетовою реакцією із саліцилатом натрію;

- за допомогою оптичного тесту Варбурга.

В останньому випадку індикаторною є реакція

глутаматдегідрогеназа

NН₄⁺ +α-кетоглутарат + НАДН+Н⁺ --> глутамат + НАД⁺ +

+ 2Н₂О.

 

Усі ці методи високоспецифічні, оскільки для уреази сечовина є єдиним фізіологічним субстратом, але найточнішим є метод із оптичним тестом Варбурга.

На сьогодні розробляється новий напрям у використанні ферментів: ферментативні методи визначення електролітів (К⁺, Nа⁺, Сl⁺). Ці методи базуються на здатності електролітів виявляти активуючу дію на активність деяких ферментів.