Глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа

 

Глюкозо-6-фосфатдегідрогеназа (Г6ФДГ; КФ 1.1.1.49) – фермент, що бере участь у процесах окиснення глюкози, каталізуючи НАДФ-залежне окиснення глюкозо-6-фосфату до 6-фосфоглюконату.

Найбільший вміст ферменту виявлений у селезінці, лімфатичних вузлах, еритроцитах і молочній залозі. Одним із основних постачальників НАДФН для глутатіонової антиоксидантної системи є пентозофосфатний шлях, ключовим ферментом якого є Г6ФДГ. У великій кількості міститься в еритроцитах і використовується в основному для виявлення спадкових захворювань, пов’язаних із дефіцитом ферменту – найбільш поширеної спадкової гемолітичної анемії, зумовленої дефіцитом активності Г6ФДГ еритроцитів. Ця спадкова патологія поширена в країнах Середземномор’я, Індії, Африки, Середньої Азії. При масових обстеженнях використовують якісний уніфікований метод – пробу Бернштейна (проба на дефіцит Г6ФДГ), що в нормі дає негативну реакцію. Гетерозигот із будь-якими варіантами дефіциту Г6ФДГ часто важко виявити і на цей момент для діагностики варіантів Г6ФДГ проводять аналіз ДНК.

У результаті порушень у будові молекули ферменту еритроцити стають неміцними й руйнуються в кровоносному руслі. Залежно від характеру і локалізації мутації в молекулі ферменту (відомо більше 200 мутантних форм Г6ФДГ) клінічні варіанти ензимопатії різні і можуть не виявлятися взагалі, виявлятися епізодичним гемолізом під впливом деяких харчових продуктів (бобові) або лікарських препаратів (протималярійні засоби хінолінового ряду, сульфаніламіди, нітрофурани, жарознижувальні засоби, протитуберкульозні препарати та ін.), вірусів гепатиту і грипу, а також супроводжуватися хронічним гемолізом, викликаючи незалежно від зовнішніх чинників хронічну несфероцитарну гемолітичну анемію (спостерігається рідко).

Еритроцитарна активність Г6ФДГ збільшується при тиреотоксикозі, введенні тиреоїдних гормонів. Підвищення активності Г6ФДГ у сироватці крові відмічається після інфаркту міокарда (пік активності спостерігається на більш пізніх термінах, ніж для АсАТ і ЛДГ) та інфаркту легені.

 

Еластаза

 

Еластаза-1 (панкреатична) (КФ 3.4.21.11) є протеолітичним ферментом, синтезується в ацинарних клітинах підшлункової залози й екскретується в просвіт дванадцятипалої кишки разом з іншими ферментами, у вигляді попередника – проеластази, що активується трипсином. Еластаза абсолютно специфічна для підшлункової залози і не детектується ні в яких інших органах або тканинах.

У сироватці крові людини містяться високоактивні інгібітори еластази: альфа-1-антитрипсин і альфа-2-макроглобулін. Інгібітори регулюють рівень активності еластази відповідно до фізіологічних потреб.

У крові здорових людей активність панкреатичної еластази-1 майже не визначається або дуже низька (норма 0,1–4,0 нг/мл).

Сироваткова еластаза внаслідок запальних процесів підшлункової залози потрапляє в загальний кровотік через ушкоджені клітинні мембрани. Подібно до інших панкреатичних ферментів (амілаза, ліпаза) показник панкреатичної еластази починає збільшуватися в крові в гострий період панкреатиту, що дозволяє поставити діагноз цього захворювання. Концентрація ферменту починає зростати вже через 6 годин від початку захворювання, а через 48 годин досягає максимальних показників, що свідчить про розвиток гострого панкреатиту. Еластаза панкреатична має триваліший період напіврозпаду, ніж амілаза й ліпаза, тому її концентрація залишається підвищеною впродовж декількох днів (в основному 3–5 днів, в окремих випадках до 10 днів). Цей тест призначається в комплексі з іншими тестами для диференціальної діагностики або підтвердження діагнозу «гострий панкреатит».

Еластаза (у калі). Людська панкреатична еластаза-1 не руйнується при проходженні по кишечнику. Визначення панкреатичної еластази-1 в калі – новий неінвазивний тест для оцінки екзокринної функції підшлункової залози. Скринінг ендокринної панкреатичної недостатності здійснюють, коли підозрюють наявність хронічного панкреатиту або кістозного фіброзу, а також при тривалому моніторингу вже виявленої недостатності підшлункової залози при хронічному панкреатиті. Орієнтуючись на рівень еластази-1 в калі, можна точніше призначати ферментні препарати та робити прогноз захворювання.

Для визначення ферменту кал збирають упродовж 72 год і аналізують того ж дня: за необхідності він може бути заморожений при –20 °С. На результати визначення панкреатичної еластази-1 в калі не впливає проведення замісної терапії препаратами ферментів підшлункової залози. Рівень еластази-1 у калі визначається імуноферментним методом із використанням моноклональних антитіл і в нормі становить не менше 200 мкг/г калу. Нижчі показники свідчать про наявність екзокринної панкреатичної недостатності. Специфічність тесту при дослідженні калу становить 94 %, чутливість – 93 %. Визначення еластази-1 у калі використовують в усіх випадках, коли є підозра на екзокринну недостатність підшлункової залози й обговорюється питання про застосування препаратів панкреатичних ферментів, оскільки використання цього методу дозволяє уникнути їх необґрунтованого призначення. Зниження активності панкреатичної еластази-1 у калі виявляють у хворих на хронічний панкреатит (важливо зазначити, що показники фекальної еластази реально взаємозв’язані з тяжкістю перебігу та швидкістю прогресування хронічного панкреатиту), рак підшлункової залози, цукровий діабет І типу (менше 100 мкг/г у 3 % хворих) і ІІ типу (менше 100 мкг/г у 12 % хворих), у дітей із муковісцидозом, що відображає недостатність екзокринної функції підшлункової залози у таких групах пацієнтів.

 

Креатинкіназа

 

Креатинкіназа, або креатинфосфокіназа (АТФ: креатин-фосфотрансфераза, КК; КФ 2.7.3.2), каталізує оборотну реакцію фосфорилювання креатину за участю АТФ, унаслідок чого утворюються креатинфосфат і AДФ.

Молекула ферменту містить дві активні тіолові групи, що відіграють важливу роль у здійсненні його каталітичної функції. У зв’язку з цим деякі тіолові сполуки (глутатіон, цистеїн) справляють на КК активуючу дію. Активність ферменту підвищується під впливом тироксину, іонів магнію, марганцю, кальцію та знижується під дією іонів цинку, міді, ртуті.

КК є димером, що складається з двох субодиниць, кожна з молекулярною масою приблизно 40 кДа. Субодиниці В (від brain – мозкова) і М (від muscle – м’язова) закодовані в різних генах. Фермент існує у вигляді трьох ізоферментів: КК-ВВ (КК-1) – мозковий, КК–МВ (КК-2) – серцевий і КК-ММ (КК-3) – м’язовий. У електричному полі найбільшу рухливість має КК-ВВ, найменшу — КК-ММ, гібридна форма КК-МВ займає проміжне положення.

КК-ВВ наявний у значних кількостях у мозку, простаті, шлунку, легенях, сечовому міхурі, уретрі, плаценті, щитовидній залозі. КК-МВ в основному знаходиться в серцевому м’язі (25–46 % від загальної активності КК кардіоміоциту) і в невеликій кількості в скелетних м’язах (менше 5 % загальної активності). КК-ММ наявний в основному в клітинах скелетних і серцевого м’язів. Активність КК-ММ у сироватці крові становить 94–96 % від загальної активності КК, КК-МВ – 4–6 %, КК-ВВ – активність слідова або не визначається. Усі три ізоферменти знайдені в цитозолі клітин або зв’язані з міофібрилами. Виявлена й четверта мітохондріальна форма креатинкінази (КК-Mt), яка відрізняється від інших форм імунологічно, а також за електрофоретичною рухливістю. Вона локалізована між внутрішньою й зовнішньою мітохондріальними мембранами, в серці становить до 15 % загальної КК активності.

Активна КК може міститися в сироватці крові у вигляді двох макромолекулярних комплексів: макро-КК тип1 і тип 2. Тип 1 – це КК-ВВ, зв’язана з IgG, або КК-ММ, зв’язана з IgA; тип 2 – це олігомери КК-Mt. Нормальна активність КК (загальна) може варіювати залежно від методу: 10–195 МО/л.

Загальна КК підвищується при багатьох захворюваннях та станах: травми, операції, інфаркт міокарда, зменшення кровопостачання м’язів, міопатії, дерматоміозит, м’язова дистрофія, міокардит, отруєння, що супроводжуються комою, гіпотиреоз, інфекційні хвороби (наприклад, черевний тиф), дегідратація, ураження електричним струмом та ін.

Ширшого застосування визначення активності КК отримало для діагностики інфаркту міокарда. Оскільки у хворих на гостру коронарну недостатність скелетна мускулатура і ЦНС, як правило, не залучені до патологічного процесу, підвищення активності КК у цих випадках, як правило, свідчить про ураження міокарда. При неускладненій стенокардії активність КК залишається нормальною. При дрібновогнищевому інфаркті міокарда чутливість тесту становить 92 %.

При інфаркті міокарда реєстроване підвищення активності КК спостерігається вже впродовж 3–6 год після ангіозного нападу. Проте визначення активності раніше 8 год дає позитивні результати в 31 % випадків. Активність КК є достовірним тестом інфаркту міокарда, починаючи з 8–10 год після початку больового нападу. Максимальний рівень активності досягається впродовж 24 год, і навіть при обширному інфаркті активність КК може повернутися до норми упродовж подальших 48 год. Відносне підвищення активності КК при інфаркті міокарда вище, ніж інших ферментів. Найбільш інформативне дослідження активності КК у динаміці – кожні 4–6 год упродовж доби. Хоча активність КК при інфаркті міокарда є дуже чутливим тестом, проте на нього не можна покладатися при одноразовому визначенні та відсутності інших показників, оскільки підвищення може бути викликане і рядом інших причин, зазначених вище, а також вживанням алкоголю, інтенсивним фізичним навантаженням, станом щитовидної залози, отруєнням снодійними засобами, введенням деяких лікарських препаратів (клофібрат, карбеноксолон). До речі, при інфаркті легені активність КК не перевищує норми, що має диференціально-діагностичне значення. Іноді невелике збільшення активності КК відмічається при застійній серцевій діяльності, тахікардії, емболії легеневої артерії. У 50–80 % випадків дистрофії Дюшена, яка має асимптоматичний перебіг, активність КК сироватки крові підвищена в 3–6 разів, при цьому рівень ферменту може нормалізуватись у період м’язового спокою.

Активність КК у сироватці, як правило, має зворотну залежність із тиреоїдною функцією щитовидної залози. Близько 60 % хворих на гіпотиреоз мають рівень КК, вищий за норму, з перевищенням верхньої межі в середньому в 5 разів. Основний ізофермент при цьому КК-ММ, хоча у 13 % хворих підвищена і КК-МВ, що свідчить про залучення до патологічного процесу не лише скелетних, але й серцевого м’яза. У той самий час у хворих на гіпертиреоз є тенденція до низьких значень активності КК у сироватці крові.

Різке підвищення активності КК (більш ніж у 10 разів) виникає на 1–2-й день порушення мозкового кровообігу, досягаючи максимуму на 3-й день.

Активність фермента значно підвищується у хворих із гострим перебігом ревматизму (ревмокардиту). При ревматоїдному артриті відмічено 5–6-кратне збільшення активності КК у сироватці крові, яке не залежить від ступеня активності запального процесу в цілому. Відмічено залежність ступеня підвищення активності КК від тривалості патологічного процесу, причому максимальні значення отримані у хворих з тривалістю захворювання від 5 до 10 років. У пацієнтів, що хворіють більше 10 років, виявлено деяке зниження активності КК, що, очевидно, пов’язано з переважанням атрофічних змін у скелетних м’язах. Найвища активність фермента відмічалася при ураженні великої кількості суглобів та патологічних змінах у скелетних м’язах.

Активність фермента підвищується при алкогольній інтоксикації (вживання алкоголю може викликати “гострий м’язовий синдром”).

До збільшення активності КК призводить гемоліз, що зумовлено виділенням у сироватку крові аденілатциклази.

Підвищені значення активності КК виявляються і в практично здорових людей після енергійних фізичних вправ, при важкій фізичній праці, спортивних навантаженнях.

Значне зменшення активності КК спостерігається при дії на пробу сироватки крові прямих сонячних або ультрафіолетових променів.

КК-ММ збільшується в сироватці при тих самих станах, що й загальна КК.

КК-МВ значно збільшується при інфаркті міокарда, визначення ізоферменту має діагностичне значення, якщо загальна активність ферменту в сироватці крові підвищується більш ніж у 1,5 раза порівняно з верхньою межею норми. Максимальна активність КК-МВ спостерігається через 20 год після прояву перших клінічних симптомів інфаркту міокарда, зниження до нормального рівня, як правило, відбувається через 40–50 год від початку захворювання. Підвищення активності КК-МВ у сироватці крові корелює з наявністю вогнища ураження міокарда, а при тривалому динамічному спостереженні – і з розміром зони некрозу. Вірогідність встановлення діагнозу інфаркту міокарда підвищується, якщо крім збільшення активності окремих ферментів крові враховувати зміну їх співвідношення. Так, у гострому періоді інфаркту міокарда співвідношення КК-МВ/загальна КК збільшується від 3 до 40 %. Крім інфаркту міокарда КК-МВ може незначно збільшуватися при міокардиті, стенокардії, затяжній аритмії, тяжких отруєннях.

Необхідно зазначити, що на цей час як специфічні маркери загибелі кардіоміоцитів використовують міокардіальні ізоформи тропоніну Т (Тн Т) і тропоніну І (Тн І). Визначення вмісту Тн Т дозволяє провести діагностику інфаркту міокарда як на ранніх, так і на пізніх термінах. Вміст Тн Т у крові підвищується вже через декілька годин після нападу стенокардії. Рівень Тн Т виявляється високим у ті терміни неускладненого інфаркту міокарда, коли рівень міоглобіну й активність КК-МВ вже стали у нормі. Тому особливо важливим є дослідження Тн Т у хворих, які госпіталізовані у стаціонар через 2–3 дні після нападу стенокардії, коли показники КК і КК-МВ можуть вже нормалізуватися. Крім того, порівняно з КК і КК-МВ вміст тропонінів у крові підвищується більшою мірою, що характеризує їх вищу діагностичну чутливість. Порівняльне дослідження Тн Т і Тн І виявило більш високу діагностичну чутливість Тн І. Так, рівень у крові Тн І при інфаркті міокарда може майже у 100 разів перевищувати верхню межу норми. Визначення Тн І можна використовувати з метою діагностики інфаркту міокарда у пацієнтів із супутнім пошкодженням скелетних м’язів. Так, виявлено, що гострі та хронічні пошкодження скелетних м’язів, надмірне фізичне навантаження, хірургічні операції (крім операцій на серці), м’язові травми не викликають підвищення рівня Тн І. Визначенню обох форм Тн Т і Тн І надається перевага при діагностиці інфаркту міокарда, що розвивається у післяопераційному періоді та після активних реанімаційних заходів.

Вважають, що активність КК-ВВ може бути тестом аноксії тканин. Активність КК-ВВ у крові може бути також наслідком гіпоксичного ушкодження мозку, особливо в умовах перинатальної гіпоксії. Активність КК-ВВ збільшена у 53 % новонароджених із асфіксією. КК-ВВ наявний у гладкій мускулатурі, але не визначається в сироватці крові у осіб із доброякісними захворюваннями цих тканин. Одним із можливих пояснень підвищення активності КК-ВВ у крові при судинних операціях є припущення, що стінки вен, як, втім, і аорти, містять тільки одну ізоформу КК, а саме КК-ВВ.

КК-ВВ у сироватці крові незначно підвищується при деяких формах раку (легені, кишечника, сечового міхура, передміхурової залози), травмі серцевого м’яза, захворюваннях сполучної тканини.

Метастазування раку передміхурової залози супроводжується дуже високими цифрами активності КК-ВВ у крові. Дослідники сходяться на думці, що активність КК-ВВ може бути використана як неспецифічний маркер пухлинного процесу. Слід зазначити, що при пухлинному процесі активність КК-ВВ у крові наявна у формі макроКК-1.

Під час пологів КК-ВВ може збільшуватися в сироватці до 6 разів (джерелом є плацента).

МакроКК тип 1 виявляється в сироватці дорослих при захворюванні шлунково-кишкового тракту, аденомі, карциномі, ушкодженнях серцевого і скелетного м’язів і у стані з високою імовірністю летального наслідку. Іноді макроКК тип 1 трапляється у жінок старше 50 років.

МакроКК тип 2 виявляється в сироватці дорослих із тяжкою формою раку або хвороби печінки, а також у дітей з ураженням серцевого м’яза. Поява КК-Mt – погана прогностична ознака, серед таких хворих висока смертність.

Аналітичні методи, що використовуються в клінічній біохімії для визначення активності КК, можуть базуватися як на прямій, так і на зворотній реакції. У ході реакції можна визначити кількість креатину або концентрацію креатинфосфату. Першими методами визначення активності КК були методи кінцевої точки; на цей час домінують кінетичні методи.

Креатинфосфат у кислому середовищі гідролізує з більшою швидкістю, ніж АДФ і АМФ, при цьому утворюються креатин і ортофосфат. Далі кількість звільненого при гідролізі ортофосфату визначають за формуванням молібденового синього в реакції Фіске-Суббароу (прямий метод). У інших реакціях звільнений при гідролізі креатин взаємодіє з нінгідрином, діацетилом або α-нафтолом із формуванням флюорофорів. Флюоресценцію останніх вимірюють при специфічних довжинах хвиль на флюоресцентному спектрофотометрі.

На сьогодні для визначення активності КК використовують кінетичну УФ-спектроскопію – референтний метод, запропонований Олівер і співавт., який базується на зворотній реакції – кінетичному визначенні креатинфосфату, що утворюється в реакції. Збільшення абсорбції реакційної суміші при довжині хвилі 340 нм і кінетичному вимірюванні дозволяє визначити активність КК у великому інтервалі активності. Подальше вдосконалення методу стосується введення в реакцію АМФ для інгібування аденілаткінази і додавання N-ацетилцистеїну з метою захисту тіолових груп ферменту від окиснення.

Існує три загальновизнані методичні підходи до розділення ізоферментів КК: електрофорез, хроматографічні та імунологічні методи.

Електрофоретичним методом (на агарі, агарозі або ацетаті целюлози) можна розділити фракції КК. Візуалізація електрофоретичних смуг ізоферментів проводиться, як правило, з використанням НАДФН флюоресценції в ультрафіолетовій області спектра (360 нм). Тому ця процедура досить трудомістка й вимагає оснащення спеціальною технікою.

Іонообмінною або абсорбційною хроматографією розділяють ізоферменти КК на декілька фракцій. Ізоферменти КК, як правило, абсорбуються на гелі, з якого потім проводиться їх елюція буферами. Випускаються спеціальні комерційні мініколонки: метод простий і швидкий, основна складність – розділення фракцій при значному підвищенні кількості КК-ММ у патологічних випадках.

Імунологічні методи базуються на вимірюванні активності КК за наявності специфічної антисироватки, що містить моноклональні або поліклональні антитіла проти М або В субодиниць. Комерційні набори, що ґрунтуються на техніці преципітації, дозволяють виявляти КК-МВ за умов її істотного підвищення з коефіцієнтом варіації 10–20 %, проте ці тести виконуються швидко, як правило, не вимагають спеціальної апаратури і можуть використовуватися індивідуально, що є особливо зручним при експрес-діагностиці. Випускаються комерційні набори для фотометричного визначення КК-МВ, що базуються на визначенні активності КК при інгібуванні М-субодиниці. Норми для відсоткового розподілу активності ізоферменту КК-МВ у загальній КК-активності в цьому випадку істотно відрізняються від електрофоретичного розподілу.

Лактатдегідрогеназа

Лактатдегідрогеназа (L-лактат: НАД-оксидоредуктаза, ЛДГ; КФ 1.1.1.27) каталізує оборотне відновлення пірувату до лактату, як кофермент використовується НАДН.

ЛДГ має молекулярну масу приблизно 134 кДа – це тетрамер, що складається з двох субодиниць – М (muscle – м’язова) і Н (heart – серцева). Субодиниця М виявляється головним чином у тканинах із анаеробним метаболізмом, у той час як субодиниця Н наявна в тканинах, де переважають аеробні процеси. У сироватці крові наявні 5 ізоферментів, що відрізняються складом субодиниць. У порядку зниження їх електорофоретичної рухливості (рух у напрямку до анода) їх позначають як ЛДГ1 (Н4), ЛДГ2 (Н3М), ЛДГ3 (Н2М2), ЛДГ4 (Н1М3), ЛДГ5 (М4). Надлишок як пірувату, так і лактату, що використовується як субстрат, пригнічує активність ферменту, при цьому ефект пірувату вищий.

ЛДГ – гліколітичний цитозольний цинковмісний фермент. Слід зазначити, що оскільки ЛДГ міститься практично в усіх клітинах організму, то вона має низькі диференціально-діагностичні можливості і тому самостійного значення визначення загальної активності ЛДГ не має. У печінці, серці, нирках, скелетному м’язі й еритроцитах активність ЛДГ більше ніж у 500 разів вища, ніж у сироватці крові, тому збільшення загальної активності ЛДГ у сироватці може бути наслідком пошкодження будь-якого з цих органів.

Підвищення показника має місце при широкому спектрі патологічних станів: некрозі тканин, особливо при гострому ураженні серця, ураженні еритроцитів, нирок, скелетних м’язів, печінки, легенів і шкіри. Значним підвищенням активності ЛДГ супроводжуються гемолітичні анемії, пов’язані з дефіцитом вітаміну В₁₂ і фолієвої кислоти. Повільне підвищення впродовж 3–4 днів із подальшим зниженням упродовж 5–7 днів може свідчити про інфаркт міокарда (необхідно, проте, виключити інфаркт легені, пухлину, мегабластну анемію). Підвищення рівня ЛДГ характерне для гострої фази інфекційного гепатиту, однак при хронічних захворюваннях печінки активність ферменту рідко виявляється підвищеною. Цирози, обтураційні жовтяниці, різні захворювання нирок і скелетних м’язів, застійна серцева недостатність дають середні цифри активності. Незначне підвищення активності ферменту відмічається при будь-яких ушкодженнях клітин, що супроводжуються збільшенням проникності мембран (інфаркт міокарда й легені), при лейкозі, лімфомах, хронічних гепатитах. ЛДГ у сечі може підвищуватися в 3–6 разів при хронічному гломерулонефриті, системному червоному вовчаку з ураженням нирок, діабетичному нефросклерозі, пухлинах нирок і сечового міхура. Проте визначення ЛДГ у сечі не практикується через інгібувальну дію на фермент кислого середовища, сечовини й деяких коротколанцюгових пептидів сечі.

Таким чином, загальна активність ЛДГ у сироватці крові не є специфічним тестом для певної патології і тому окреме вимірювання цього показника практично не проводиться у медичній практиці. Тому для диференціальної діагностики захворювань більш доцільно досліджувати зміни спектра ізоферментів ЛДГ і потім оцінювати внесок кожного з них у загальну активність, оскільки вони є більш органоспецифічними.

Нормальне співвідношення ізоферментів ЛДГ у сироватці крові становить: ЛДГ1 – 14–26 %; ЛДГ2 – 29–39 %; ЛДГ3 – 20–26 %; ЛДГ4 – 8–16 %; ЛДГ5 – 6–16 %. Отримані й дещо інші варіанти розподілу ізоферментів ЛДГ у сироватці крові здорових осіб, проте в усіх спостереженнях відсотковий вміст ЛДГ2 у сироватці крові був вищим, ніж ЛДГ1.

У різних тканинах та органах ізоферменти ЛДГ подані в різних співвідношеннях (табл. 3).

 

Таблиця 3 – Співвідношення (%) ізоферментів ЛДГ

Ізофер-мент	Серцевий м’яз	Нирки	Еритро-цити	Скелет-ні м’язи	Печінка
ЛДГ1					0,2
ЛДГ2					0,8
ЛДГ3
ЛДГ4
ЛДГ5

 

Шостий ізофермент ЛДГ (ЛДГ-Х) виявляється в яєчках дорослих осіб разом із п’ятьма ізоферментами, які містяться в інших тканинах. ЛДГ-Х є тетрамером, що складається із 4 ідентичних Х-субодиниць, які відрізняються за амінокислотним складом від Н- і М-субодиниць. ЛДГ-Х має рухливість, проміжну відносно рухливості ЛДГ3 і ЛДГ4. Цей ізофермент, імовірно, пов’язаний із сперматогенезом. 80 % активності ЛДГ сперматозоїдів зумовлено цим ізоферментом.

Кількість ізоферментів можна визначити за допомогою електрофоретичних, імунологічних, кінетичних методів або шляхом хроматографії.

Найбільш поширений метод електрофорезу на гелі агарози або на плівках із ацетату целюлози. Найбільшу роздільну здатність і чутливість має метод іонообмінної хроматографії, він використовується як референтний відносно електрофорезу. Запропонований також метод імунопреципітації з використанням антитіл проти всіх ізоферментів, що містять М-субодиницю (ЛДГ2–ЛДГ5). У цьому випадку активність цих ізоферментів не виявляється, залишається активною тільки ЛДГ1. Результати визначення ЛДГ1 цим методом тісно корелюють із результатами електрофорезу й хроматографії, а діагностична специфічність методу для інфаркту міокарда становить 94 %. Іншим, порівняно новим методом виявлення активності ЛДГ1 є використання суміші, що пригнічує активність усіх ізоферментів, які містять М-субодиницю. Такою сумішшю є: 1,6-гексанедіол (700 мМ), перхлорат натрію (825 мМ) і хінідинтіоціанат (190 мМ). Результати також тісно корелюють із даними електрофорезу та імуноінгібування.

ЛДГ1 найшвидше просувається до анода при електрофорезі, є термостабільною, інгібується високими концентраціями пірувату та меншою мірою сечовиною й оксалоацетатом. Реакція перетворення лактату на піруват, що каталізується ЛДГ1, відбувається в органах із переважно аеробним метаболізмом, де лактат є субстратом окиснення. Із нього утворюється піруват, який потім через ацетил-СоА окиснюється до СО₂ і Н₂О, при цьому енергія акумулюється у вигляді молекул АТФ у процесі окиснювального фосфорилювання. ЛДГ1 наявний у високих концентраціях у серці, нирках, мозку, багато ЛДГ1 в еритроцитах. Тому гемоліз недопустимий при визначенні активності ЛДГ1.

Оскільки ЛДГ може окиснювати також α-гідроксибутират до α-оксибутирату (в цьому випадку говорять про α-гідроксибутиратдегідрогеназну активність (α-ГБДГ)), то як аналог ЛДГ1 часто рекомендується визначення α-ГБДГ, хоча активність α-ГБДГ дещо вища, ніж ЛДГ1, це пов’язано з тим, що α-ГБДГ-активність мають усі без винятку ізоферменти ЛДГ.

Показник співвідношення α-ГБДГ/ЛДГ у сироватці крові в нормі становить 0,62–0,82. У випадку інфаркту міокарда навіть через 14 діб від початку захворювання, незважаючи на нормальну загальну активність ЛДГ, коефіцієнт відношення α-ГБДГ/ЛДГ залишається підвищеним.

Співвідношення α-ГБДГ/ЛДГ використовується для диференціальної діагностики інфаркту міокарда і нападу стенокардії, легеневої емболії, панкреатиту, перфорації язви, при яких виявляються нормальні або знижені його значення.

При діагностиці інфаркту міокарда збільшення активності ЛДГ є достовірним тестом у період від 12 до 32 годин після больового нападу. Активність ферменту залишається підвищеною впродовж 8–14 днів. У хворих на стенокардію активність ЛДГ у сироватці крові не збільшується. Одноразове дослідження ЛДГ1 має клінічну специфічність стосовно інфаркту міокарда у 66 % випадків, а визначення її в динаміці (через кожні 4–6 годин упродовж доби) – у 86 % випадків. Усі 5 ізоферментів ЛДГ наявні в кардіоміоцитах, вміст ЛДГ1 в ізоферментному спектрі міокарда становить 55–65 %. Викид міокардіальних ізоферментів ЛДГ у сироватку крові приводить до збільшення активності ЛДГ1 і ЛДГ2, при цьому активність ЛДГ1 буде вищою. Якщо в термін від 8 до 24 годин після нападу ангіозних болів немає наростання активності ЛДГ (а також КК-МВ і АсАТ), то немає й інфаркту. У частини хворих спостерігається кореляція між рівнем ЛДГ і обширністю інфаркту. У деяких випадках додаткову інформацію дає коефіцієнт ЛДГ1/ЛДГ2, який у нормі становить 0,6–0,7. При гострому інфаркті міокарда він стає вище 1,0 і повертається до норми через 2–3 тижні. α-ГБДГ при інфаркті міокарда підвищується в ті самі часові інтервали, що й ЛДГ, досягає максимуму на 2–3-й день і відновлюється до норми на 10–20-й день.

Підвищення ЛДГ1 відмічається також при пухлинах репродуктивних органів: тератомі, семіномі яєчка, дисгерміномі яєчника.

Активність ЛДГ зазнає гормонального впливу. Так, великі дози тироксину знижували синтез ферменту, при цьому здебільшого відмічено інгібування синтезу субодиниці М. Норадреналін і адреналін викликають збільшення загальної активності ЛДГ із переважанням активності ЛДГ1 і ЛДГ2. Активність ферменту в крові зростає при дії анаболічних стероїдів і етанолу, а також ряду медикаментозних препаратів – клофібрату, кофеїну, сульфаніламідів та ін.

ЛДГ2, ЛДГ3 і ЛДГ4 мають проміжні властивості. Активність цих ізоферментів підвищується при масивному руйнуванні тромбоцитів (емболія легеневої артерії, масивні гемотрансфузії) і залученні до патологічного процесу лімфатичної системи. При нелімфоцитарних лейкозах збільшується активність ЛДГ3 і ЛДГ4, причому ступінь збільшення залежить від кількості незрілих клітин. Тромбоз легеневої артерії характеризується переважним збільшенням активності ЛДГ3 і менш значним – ЛДГ4. Активність ЛДГ3 підвищується при захворюваннях нирок, ураженнях серцево-судинної системи з переважанням недостатності в малому колі кровообігу, що викликають порушення метаболічних процесів у легеневій тканині. Зростання активності ЛДГ3 іноді спостерігається при гострому панкреатиті. Активність ЛДГ4 зростає при ураженні печінки вірусного, токсичного або травматичного характеру та загостренні хронічних гепатитів, в активну фазу ревматизму, при кардіосклерозі з порушенням гемодинаміки, гострому нефриті, при ураженнях нирок, пухлинах печінки, передміхурової залози, шийки матки, молочної залози, кишечника, при тяжких формах діабету.

ЛДГ5 при електрофорезі просувається до анода повільніше за інші ізоферменти, є термолабільним, більш чутливим до інгібуючого впливу сечовини й оксалоацетату та має найменшу спорідненість до α-кетобутирату (порівняно з іншими ізоферментами ЛДГ). Найбільший уміст цього ізоферменту характерний для скелетних м’язів, печінки, шкіри, слизових оболонок, а також клітин деяких злоякісних пухлин. Значне збільшення вмісту ЛДГ5 відмічається при травмах, запальних і дегенеративних захворюваннях м’язів і багатьох хворобах печінки (гепатити, цирози та ін.). Онкологічні захворювання (наприклад, лімфолейкози) можуть також супроводжуватися збільшенням ЛДГ5. Активність ЛДГ5 підвищується в активну фазу ревматизму, при значному ураженні нирок, що супроводжується їх гіпоксією, пухлинах нирок і відторгненні пересадженої нирки, а також при тяжких формах діабету.

Останнім часом описано багато випадків низької активності ЛДГ у сироватці крові. Існують дві групи причин, що зумовлюють зниження активності ферменту в крові та тканинах. Одна з них пов’язана з наявністю інгібітора в сироватці крові, інша – з генетичними порушеннями. Дійсно, в сироватці крові навіть практично здорових дорослих людей існує термозалежний інгібітор, наявність якого знижує активність ЛДГ. При дослідженні 20000 зразків сироватки крові виявлено 42 випадки низької активності ЛДГ. Інгібіторами активності ЛДГ крові є IgG, IgA, IgM. Описані випадки утворення антитіл до ЛДГ під час приймання сульфаніламідних препаратів; після відміни препаратів антитіла зникали. Низька активність ЛДГ у сироватці крові може бути пояснена не тільки інгібуванням, але й зменшенням часу перебування в крові, швидкою елімінацією імунних комплексів із циркуляції.

Вторинна причина низької активності ЛДГ у сироватці крові і тканинах пов’язана з генетичними порушеннями. Описані особливі варіанти Н-субодиниць у американських індійців, ферментативно неактивні, оскільки у складі тетрамеру була наявна тільки одна активна субодиниця. Повна відсутність Н- або М-субодиниць відмічена в японській популяції. Поширеність гетерозигот із дефіцитом субодиниць ЛДГ становить 0,15–0,2 %. Клінічно гомозиготи із дефіцитом М-субодиниць мають періодичну міоглобінурію після фізичного навантаження, ураження шкіри; пологи у них проходять тяжко.

Зменшення активності ЛДГ викликають також оксалати (що використовуються як антикоагулянти) та сечовина.

Стабільність активності ЛДГ залежить від температури зберігання та складу середовища. Загальна активність ЛДГ знижується на 10 % через 1 добу зберігання при 4 °С. При зберіганні різні зразки сироватки крові значно відрізняються за ступенем зміни загальної активності ЛДГ і співвідношенням її ізоферментів. Є дані, що зберігання проб замороженими призводить до значних змін у розподілі ізоферментів – зменшення частки малорухливих ізоферментів і збільшення швидких фракцій, що може бути причиною помилкового збільшення відношення ЛДГ1/ЛДГ2. ЛДГ1 і ЛДГ2 зберігають активність незмінною впродовж 10 днів при зберіганні як при 4 °С, так і при -20 °С або 20 °С. Активність ЛДГ4 знижується на 50 % через 48 год зберігання при 4 °С. У цих самих умовах активність ЛДГ5 виявилася зниженою на 72 %. Тому рекомендують визначати активність ЛДГ і співвідношення її фракцій у день взяття крові на аналіз, а якщо такої можливості немає, то зберігати сироватку необхідно впродовж 24 год при кімнатній температурі.

Лейцинамінопептидаза

 

Лейцинамінопептидаза (L-лейцилпептидгідролаза, ЛАП, КФ 3.4.1.1) – фермент, що специфічно впливає на N-кінцеві амінокислотні залишки білків. Проявляючи найбільшу активність стосовно субстрату, N-кінцевою амінокислотою якого є альфа-лейцин, фермент руйнує разом із тим пептидні зв’язки білка (N-кінцевих фенілаланіну, триптофану, гістидину або тирозину).

ЛАП лише одна з декількох внутрішньоклітинних амінопептидаз, на яку особливо багаті жовчовивідна система, підшлункова залоза й слизова тонкої кишки.

Фермент проникає в сечу: на думку одних авторів, – із крові за рахунок фільтрації через клубочковий фільтр; на думку інших, – шляхом секреції в сечу клітинами проксимальних канальців нефрону.

ЛАП являє собою гетерогенний фермент. Окремі ізоензими, що розміщуються в ділянці альфа-2-, бета- і гамма-глобулінів, містяться в печінці, плаценті та інших органах.

ЛАП відносно специфічна для захворювань гепатобіліарної системи та, як правило, не підвищується при ураженні кісток. Тому визначення ЛАП використовується для диференціальної діагностики захворювань гепатобіліарної системи та кісткової тканини, коли підвищена активність ЛФ. ЛАП – чутливіший показник холедохолітіазу й местастазів у печінку у хворих без жовтяниці, ніж ЛФ. При гострому інфекційному гепатиті активність ЛАП, як і трансаміназ, підвищена вже у продромальному періоді і може в 100 разів перевищувати верхню межу норми. Нормалізація її відбувається пізніше, ніж нормалізація трансаміназ. При хронічному гепатиті, що супроводжується незміненою активністю АсАТ і АлАТ, активність ЛАП підвищена. Її визначення знайшло використання для раннього виявлення інфекційного гепатиту, контролю за його перебігом, установлення особливостей захворювання та ефективності проведеної терапії.

Збільшення активності ЛАП спостерігається при холестазі, перніціозній анемії.

Помітно підвищена активність цього ферменту при обтураційній жовтяниці, метастазах раку в печінку, панкреатиті і холециститі, навіть якщо вони не супроводжуються жовтяницею. Визначення активності ЛАП має таке саме клініко-діагностичне значення, як і визначення активності ЛФ.

Активність ЛАП зростає в останньому триместрі вагітності, що пов’язано з появою плацентарного ізоферменту в сироватці крові (нормалізація настає через 6–8 тижнів після пологів). Активність ферменту в сироватці крові підвищується і при раку підшлункової залози.

У хворих на гострий гломерулонефрит активність ферменту в сечі перевищує норму в 6 разів, у хворих із загостренням хронічного нефриту – у 4 рази. Високий рівень ЛАП у сечі свідчить про нежиттєздатність донорської нирки.

Активність ЛАП у сироватці крові може підвищуватися під час приймання аміназину, естрогенів, оральних контрацептивів, морфіну.

Для визначення активності ЛАП використовують методи кінцевої точки і кінетичні.