Сыворотке крови уреазным методом

 

Принцип метода: мочевина под действием фермента уреазы разлагается на СО₂ и NН₃, последний в реакции с салицилатом натрия и гипохлоридом натрия в присутствии нитропруссида натрия образует окрашенный продукт, интенсивность окраски которого пропорциональна концентрации мочевины в пробе.

Реактивы и оборудование: 1) реагент 1 – раствор уреазы в фосфатном буфере; раствор салицилата натрия и нитропруссида натрия; 2) реагент 2 – раствор гипохлорита натрия и гидроокиси натрия; 3) образцы сыворотки крови; 4) калибровочный раствор мочевины с концентрацией 5,0 ммоль/л; 5) пробирки, пипетки; 6) термостат; 7) ФЭК.

Ход работы:

 

	Опытная проба	Калибровочная проба	Контрольная проба
Реагент 1	1,0 мл	1,0 мл	1,0 мл
Сыворотка	0,02 мл	-	-
Калибратор	-	0,02 мл	-
Дистиллированная вода	-	-	0,02 мл

 

Пробы перемешать и инкубировать 5 мин при температуре 37⁰С, затем добавить:

Реагент 2

1,0 мл

1,0 мл

1,0 мл

 

После добавления реагента 2 пробы перемешать и инкубировать 5 мин при температуре 37⁰С.

Измерить оптическую плотность опытной (Д) и калибровочной (Д_к) проб против контрольной пробы при λ = 610 нм. Окраска стабильна в течение 2 час.

Результаты: Д₁=

Д₂= Д_к=

 

Для расчета концентрации мочевины использовать формулу:

 

С=Д₁/Д_к х 5,0 (ммоль/л)

С₁=

С₂= Норма: 2,5 – 8,3 ммоль/л

 

Выводы:

 

Количественное определение мочевины в моче

Цветной реакцией с парадиметиламинобензальдегидом

Принцип метода: мочевина, взаимодействуя с парадиметиламинобензальдегидом в кислой среде, образует окрашенное в желто-зеленый цвет соединение. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации мочевины в пробе. Оптическую плотность раствора определяют методом фотоэлектроколориметрии.

 

Реактивы и оборудование: 1) 2%-водный раствор парадиметиламино-бензальдегида (пДАБ), 2) образцы мочи, 3) пробирки, 4) пипетки, 5) ФЭК.

Ход работы: к 0,5 мл мочи (предварительно разведенной в 100 раз) добавить 2,5 мл 2% водного раствора пДАБ и тщательно перемешать. Через 15 мин определить оптическую плотность раствора на ФЭК, используя синий светофильтр (l=400 нм) и кюветы с рабочим расстоянием 10 мм. В качестве раствора сравнения использовать контроль, содержащий 0,5 мл воды и 2,5 мл 2% водного раствора пДАБ. Определить содержание мочевины в пробе (мг/мл) с использованием калибровочного графика. Рассчитать содержание мочевины в моче в

 

ммоль/сутки.

Результаты: D₁= С₁= мг/мл

 

D₂= С₂= мг/мл

 

Формула: С ^. В ^. 1,5 ^. 16,6 = (ммоль/сут)

 

где С – концентрация мочевины мг/мл

(по калибровочному графику)

В – разведение мочи (100 раз)

1,5 - среднесуточный диурез (л)

16,6 – коэффициент пересчета в единицах СИ

 

Количественное определение креатинина в крови и моче

Креатинин является компонентом остаточного азота крови. Это конечный продукт превращения креатинфосфата в мышцах, мозге. Креатинфосфат в свою очередь участвует в энергообеспечении данных тканей. При участии фермента креатинкиназы происходит расщепление креатинфосфата с образованием энергии и креатинина, который экскретируется из организма с мочой. Основное диагностическое использование креатинина – это оценка почечной фильтрации. При нарушении фильтрации в почках происходит нарастание креатинина в крови и снижение его в моче. По содержанию креатинина в крови и моче можно рассчитать клиренс креатинина, данный показатель позволяет оценить скорость почечной фильтрации. При нарушении

функции почек клиренс креатинина снижается. Повышение экскрекции креатинина с мочой может наблюдаться при лихорадочных состояниях, недостаточности печени, инфекционных заболеваниях, а также при высоких физических нагрузках. По количеству выделяемого креатинина можно судить об интенсивности физической нагрузки у спортсменов и тренированности мышц. Уменьшение креатинина в моче связано с мышечной атрофией, параличами, хроническими заболеваниями почек (амилоидоз). Определение содержания креатинина в сыворотке (плазме) крови и моче основано на реакции Яффе.

Принцип метода: креатинин в щелочной среде реагирует с пикриновой кислотой с образованием комплекса желто-красного цвета. Скорость

образования комплекса пропорциональна содержанию креатинина в исследуемом материале. Нормы: в сыворотке крови женщины – 44-88 мкмоль/л, мужчины – 44-100 мкмоль/л (нормы могут варьировать в зависимости от конкретного метода); в моче – 4,4-17,7 ммоль/сутки.

Тестовый контроль по теме «Обезвреживание аммиака.

Остаточный азот крови»

Тест 1

ВыбЕрИтЕ правильнЫЙ ответ.

Ферменты орнитинового цикла локализованы:

а) на мембране митохондрий

б) в цитозоле клетки

в) на мембранах комплекса Гольджи

г) и на мембранах митохондрий и в цитозоле клетки

д) и на мембранах комплекса Гольджи и в цитозоле

Тест 2

ВыбЕрИтЕ правильнЫЙ ответ.

Орнитиновый цикл в митохондриях протекает до образования:

а) аргининосукцината

б) карбамоилфосфата

в) фумарата

г) цитруллина

д) аргинина

Тест 3

ВыбЕрИтЕ правильнЫЙ ответ.

Транспортными формами аммиака в организме принято считать:

а) ГЛУ, ГЛН

б) ГЛН, АСН

в) аммонийные соли

г) ГЛУ, АСП

д) мочевину

Тест 4

ВыбЕрИтЕ ВСЕ правильныЕ ответЫ.

Глюкозо-аланиновый цикл включает реакции:

а) декарбоксилирования ГЛУ

б) декарбоксилирование ПВК

в) восстановительное аминирование a-кетоглутаровой

г) восстановительное аминирование ПВК

д) переаминирование ГЛУ и ПВК

 

Тест 5

Установите соответствие

(для каждого вопроса – один или несколько правильных ответов, каждый ответ может быть использован один раз или не использован совсем)

Процессы, в ходе которых образуются метаболиты:	Метаболиты:
1) обезвреживание NН3 2) обезвреживание бензойной кислоты 3) обезвреживание продуктов гниения триптофана	1) а) мочевина б) гиппуровая кислота в)индикан г) аммонийные соли д) креатинин

Тест 6

ВыбЕрИтЕ правильнЫЙ ответ.

Общим метаболитом ЦТК и орнитинового цикла является:

а) оксалоацетат

б) глутамат

в) сукцинат

г) аспартат

д) фумарат

Тест 7

Установите соответствие

(для каждого вопроса – один или несколько правильных ответов, каждый ответ может быть использован один раз)

Органы синтеза данных метаболитов:	Метаболиты:
1) Печень 2) почки 3) мышцы	а) мочевина б) аммонийные соли в) гиппуровая кислота г) индикан д) креатинин

 

Тест 8

ВыбЕрИтЕ правильный ответ.

Патология почек сопровождается:

а) снижением содержания мочевины в крови и моче

б) снижением содержания мочевины в крови и повышением в моче

в) повышением показателей мочевины в крови и моче

г) увеличением содержания мочевины в крови; снижением мочевины и ростом аммонийных солей в моче

д) увеличением содержания мочевины в крови; снижением мочевины и аммонийных солей в моче

Тест 9

ВыбЕрИтЕ правильнЫЙ ответ.

Патология печени сопровождается:

а) повышением содержания мочевины в крови и понижением в моче

б) снижением содержания мочевины в крови и нарастанием в моче

в) снижением мочевины в крови, снижением мочевины и аммонийных солей в моче

г) снижением содержания мочевины в крови и моче, ростом аммонийных солей в моче

д) ростом мочевины в крови и моче

Тест 10

ВыбЕрИтЕ ВСЕ правильныЕ ответЫ.

Содержание аммонийных солей в моче может нарастать при:

а) заболевании почек

б) заболевании печени

в) сахарном диабете

г) ацидозе

д) алкалозе

Тест 11

Выберите ВСЕ правильнЫе ОТВЕТы.

Глюкозо-аланиновый цикл включает процессы:

а) переаминирования глутаминовой кислоты с ПВК

б) превращения глутаминовой кислоты в глутамин

в) транспорта аммиака в печень в виде аланина

г) транспорта ПВК в печень в виде аланина

д) переаминирования аланина в печени с a-кетоглутаровой кислотой

 

Тест 12

Дополните ОТвет.

Значение глюкозо-аланинового цикла заключается в том, что в виде аланина из мышц одновременно выводятся два токсических продукта обмена: ____________ и __________, также поддерживается безопасный уровень __________ в крови.

Тест 13

ВыбЕрите все правильные ответы.

Реакциями первичного обезвреживания аммиака являются:

а) синтез аммонийных солей

б) синтез глутамина

в) восстановительное аминирование a-кетоглутаровой кислоты

г) декарбоксилирование глутамина

д) синтез креатинина

Тест 14

Дополните ответ.

Первой реакцией орнитинового цикла является синтез ____________. Фермент, катализирующий реакцию - ______________.

Тест 15

Дополните ответ.

Последней реакцией орнитинового цикла является гидролиз ________ с образованием ___________ и ______________.

Тест 16

Установите соответствие

(для каждого вопроса – один правильный ответ, каждый ответ может быть использован один раз или не использован совсем)

Метаболиты:	Процессы, в ходе которых дан­ные метаболиты образуются:
1) мочевина 2) мочевая кислота 3) ГЛН, АСН 4) индикан	а) обезвреживание продуктов гниения б) обмен пуриновых оснований в) обмен пиримидиновых оснований г) орнитиновый цикл д) процессы первичного обезвреживания аммиака

 

ОТВЕТЫ по теме: “ОБЕЗВРЕЖИВАНИЕ АММИАКА. ОСТАТОЧНЫЙ АЗОТ КРОВИ”

1. г

2. г

3. б

4. в, д

5. 1аг 2б 3в

6. д

7. 1авг 2б 3д

8. д

9. г

10. б,в,г

11. а,в,г,д

12. ПВК аммиак глюкозы

13. б,в

14. карбамоилфосфата, карбамоилфосфатсинтаза

15. аргинина, мочевины, орнитина

16. 1г, 2б, 3д, 4а

1. Тема 24. Возможные нарушения белкового обмена при действии факторов внешней среды и различных патологических состояниях

Самостоятельная работа студентов в аудиторное время

Место проведения - кафедра биохимии

Продолжительность занятия - 180 минут

 

2. Цель занятия: Научить студентов оценивать нарушения обмена белков путем решения ситуационных задач, используя литературу по предложенной теме.

 

3. Конкретные задачи:

3.1. Студент должен знать:

3.1.1. Этапы обмена белков.

3.1.2. Витамины и их биологическая роль.

3.1.3. Ферменты и механизм их ингибирования.

3.2. Студент должен уметь:

3.2.1. Анализировать, обобщать, излагать литературный материал для решения ситуационной задачи.

3.2.2. Интерпретировать данные биохимических и других лабораторных исследований для оценки нарушений белкового обмена.

4. Мотивация: знания и навыки, полученные на занятии, развивают аналитическое мышление и могут быть использованы в практической работе для контроля состояния здоровья людей при воздействии факторов внешней среды и нарушении обмена белков.

 

5. Задание для самоподготовки: студенты должны проработать рекомендуемую литературу, используя вопросы для самоподготовки.

Рекомендуемая литература.

Основная:

5.1.1. Лекционный материал по теме: "Обмен простых белков".

5.1.2. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. "Биологическая химия" М., Медицина. - 1998. – С.220-228, 409-468, 568-572, 580-582, 619-624, 658-659.

5.1.3. Биохимия: Учебник / Под ред. Е.С.Северина. – М.; ГЭОТАР-МЕД, 2003. – С.468, 502-504, 509-512, 529-531.

5.2. Подготовиться к тестовому контролю

 

6. Вопросы для самоподготовки:

6.1. Источники и пути использования аминокислот в организме.

6.2. Суточная потребность белков, виды азотистого баланса.

6.3. Какие витамины участвуют в промежуточном обмене аминокислот?

6.4. Каким образом и в каких органах происходит конечное обезвреживание аммиака в организме?

6.5. Каким путем удаляются из организма конечные продукты

белкового обмена?

6.6. Какие азотсодержащие компоненты присутствуют в крови и в моче?

6.7. Как изменяется количество азотсодержащих компонентов в крови и в моче при заболеваниях печени, почек и мышц?

6.8. Какие нарушения обмена индивидуальных аминокислот вам

известны? Какова причина нарушения обмена аминокислот?

6.9. Какие нарушения белкового обмена наблюдаются при действии солей тяжелых металлов?

6.10. Какие нарушения белкового обмена наблюдаются при действии гидразина?

6.11. Какие нарушения белкового обмена наблюдаются при действии этиленгликоля, дихлорэтана и др. химических агентов?