Установление ингибирующих веществ с индикатором резазурином.

Метод основан на восстановлении резазурина при развитии в молоке чувствительных к ингибирующим веществам микроорганизмов вида Streptoccocus thermophilus.

Чувствительность метода позволяет обнаружить в молоке содержание пенициллина более 0,01 МЕ/мл; формалина — около 0,005%; перекиси водорода — более 0,01%.

Приборы и реактивы: стерилизатор паровой медицинский, редуктазник или баня водяная, термостат, позволяющий поддерживать температуру от 30 до 50ºС,термометры стеклянные жидкостные, весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности, пробирки стеклянные, пипетки, колбы, штатив для пробирок, пробки резиновые, резазурин (индикатор), молоко обезжиренное стерильное, тест-культура коллекционная (штамм Streptoccocus thermophilus).

Проведение анализа. В чистые пробирки наливают по 10 см³ исследуемого молока и закрывают стерильными резиновыми пробками. Оставшуюся часть пробы сохраняют до конца анализа в холодильнике при температуре 6—8°С.

Одновременно проводят контрольный анализ. Для этого в пробирку наливают 10 см³ молока, предварительно проверенного накануне на отсутствие ингибирующих веществ. Это молоко может храниться до анализа в холодильнике при 6-8°С не более суток.

Пробирки с исследуемым молоком и контрольной пробой нагревают в водяной бане до 85-90°С с выдержкой 10 мин, затем охлаждают до 43-45°С. После этого в пробирки стерильной пи­петкой вносят по 0,3 см³ рабочей тест-культуры. Содержимое пробирок тщательно перемешивают путем трехкратного перевертывания, после чего пробирки выдерживают в течение 2 ч при температуре 42-43°С в редуктазнике или водяной бане с терморегулятором.

В пробирки с исследуемым молоком и контрольной пробой вносят по 1 см³ 0,05%-ного раствора резазурина с температурой не ниже 18—20°С. Содержимое пробирок тщательно перемешивают.

Пробирки с исследуемым молоком и контрольной пробой выдерживают в редуктазнике или водяной бане с терморегулятором при 42—43°С в течение 15 мин.

При отсутствии в исследуемом молоке ингибирующих веществ (и в контрольной пробе) содержимое пробирок будет иметь розовый или белый цвет.

При наличии в молоке ингибирующих веществ содержимое пробирок будет иметь сине-стальную, сине-фиолетовую или фиолетовую окраску.

2. Установление наличия хлорсодержащих ингибиторов (гипохлорита и хлорамина).

Приборы и реактивы: пробирки, пипетки градуированные 5 и 2 см³, баня водяная на 85°С, палочки стеклянные, 7%-ный раствор йодистого калия, 15%-ный раствор крахмала, разбавленная соляная кислота в соотношении 1:2, вода дистиллированная.

Проведение анализа.

В пробирку отмеривают 5 см³ молока и добавляют 1,5 см³ раствора йодистого крахмала. Содержимое пробирки тщательно перемешивают и оценивают цвет пробы. Желтый оттенок свидетельствует о наличии хлора.

Если цвет не изменился, то добавляют 4 см³ разбавленной соляной кислоты, тщательно перемешивают палочкой и вновь оценивают цвет пробы. Желтый цвет указывает на наличие хлора.

Затем пробирки помещают в водяную баню, нагретую до температуры 85°С и выдерживают 10 мин (в это время сгусток поднимается на поверхность), затем быстро охлаждают. Далее в сыворотку под сгустком добавляют 1 см³ раствора крахмала и оценивают полученный цвет. При наличии хлора в молоке сыворотка приобретает окраску от слабо-фиолетовой до фиолетово-коричневой.

3. Установление наличия формалина. Формалин добавляют в молоко как консервирующее вещество. Такое молоко непригодно к употреблению и для переработки. Приборы и реактивы: пробирки, пипетки вместимостью 2 см³, серная кислота. Проведение анализа. В пробирку отмеривают 2 см³ серной кислоты, а затем осторожно, не допуская смешивания, по стенке добавляют 2 см³ молока.При наличии формалина на границе соприкасающихся жидкостей образуется фиолетовое кольцо, без формалина - желтое. 4. Установление наличия перекиси водорода осуществляют согласно ГОСТ 24067-80 «Молоко. Метод определения перекиси водорода». Перекись водорода также является ингибитором, препятствующим размножению микроорганизмов и скисанию молока. Такое молоко непригодно к употреблению и для переработки. Приборы и реактивы: пробирки, пипетки вместимостью 1 см³, капельница, серная кислота, крахмальный раствор йодистого калия. Приготовление раствора серной кислоты: 1 объемную часть серной кислоты смешивают с 3 объемными частями дистиллированной воды; Приготовление крахмального раствора йодистого калия: 3 г крахмала растворяют в 20 см³ воды и добавляют 80 см³ кипящей воды. После охлаждения к крахмальному раствору добавляют 3 г йодида калия, растворенного в 5-10 см³ воды Проведение анализа. В пробирку отмеривают 1 см³ молока, добавляют 0,2 см³ йодистокалиевого крахмала, размешивают и добавляют 2 капли серной кислоты.При наличии перекиси водорода молоко синеет. Отсутствие изменения окраски в течение 10 мин указывает на то, что в молоке перекиси водорода нет. Кроме ингибирующих веществ, молоко может быть фальсифицировано содой или крахмалом. 5. Установление наличия соды осуществляют согласно ГОСТ 24065-80 «Молоко. Методы определения соды». Для снижения кислотности и предохранения молока от скисания к нему прибавляют соду. Нейтрализованное содой молоко быстро портится, так как лишается естественных бактерицидных свойств, и в нем развиваются гнилостные бактерии с образованием вредных для организма человека веществ. Определить наличие соды в молоке можно пробами с индикатором бромтимоловым синим, с розоловой кислотой и пробой с аспирином. Проба с бромтимоловым синим. Индикатор бромтимоловый синий является индикатором щелочных ингибиторов, каким является сода. Приборы и реактивы: пробирки, пипетки вместимостью 5 см³, капельница, 0,04%-ный раствор индикатора бромтимоловый синий. Проведение анализа. В пробирку, помещенную в штатив, наливают 5 см³ исследуемого молока и осторожно, по стенке добавляют 7-8 капель 0,04%-ного раствора индикатора бромтимоловый синий. Через 10 мин наблюдают за изменением окраски кольцевого слоя, не допуская встряхивания пробирки. Желтая окраска указывает на отсутствие соды  в молоке. Появление зеленой окраски различных оттенков (от светло-зеленого до темно-зеленого) свидетельствует о наличии соды в молоке. Проба с розоловой кислотой. Розоловая кислота является индикатором, изменяющим свою окраску в кислых и щелочных растворах. В ней-                                                   тральных и слабокислых растворах эта кислота дает оранжевую окраску (свежее молоко), в слабощелочных она переходит в малиново-красную. Приборы и реактивы: пробирки, пипетки вместимостью 5 см³,  0,2%-ный раствор розоловой кислоты. Проведение анализа. В пробирке смешивают равные объемы молока и 0,2 %-ного раствора розоловой кислоты, а затем устанавливают цвет смеси. В присутствии соды молоко окрасится в малиново-красный цвет, при отсутствии ее - в оранжевый. Проба с аспирином. При наличии соды аспирин омыляется с образованием уксуснокислого и салициловокислого натрия, которые при прибавлении хлористого железа делают окрашивание содержимого в темно-розовый или красновато-желтый цвет, а затем образуется осадок того же цвета. Приборы и реактивы: водяная баня, пробирки, пипетки вместимостью 10 см³, капельница, фильтры бумажные, аспирин, вода дистиллированная, 10%-ный раствор хлорного железа. Проведение анализа. В колбу наливают 10 см³ молока, 10 см³ дистиллированной воды и 2 см³ насыщенного раствора аспирина, содержимое колбы перемешивают и нагревают в водяной бане при 60-65 °С в течение 1 часа и фильтруют содержимое. К прозрачному фильтрату добавляют от 8 до 10 капель 10 %-ного раствора хлорного железа. Появление окраски от темно-розовой до красновато-желтой, а затем и осадка, указывает на наличие в молоке соды. 6. Установление наличия аммиака осуществляют согласно ГОСТ 24066-80 «Молоко. Метод определения аммиака». Приборы и реактивы: баня водяная, стаканы химические,пробирки, пипетки вместимостью 1 и 2 см³, цилиндры вместимостью 25 см³, реактив Несслера, 10-ный раствор уксусной кислоты. Проведение анализа. В стаканчик наливают около 20 см³ молока и нагревают на водяной бане при температуре 40-45°С в течение 2-3 мин. В подогретое молоко вносят 1 см³ 10%-ного раствора уксусной кислоты и оставляют на 10 мин для осаждения казеина.Пипеткой (с ваткой на нижнем конце для предотвращения попадания казеина) отбирают 2 см³ сыворотки и переносят в пробирку, добавляют туда 1 см³ реактива Несслера и содержимое перемешивают, наблюдая за изменением окраски в течение 1 мин. Появление лимонно-желтой окраски указывает на наличие аммиака в количестве, характерном для натуральности молока. Появление оранжевой окраски различной интенсивности указывает на наличие аммиака выше его естественного содержания. 7. Установление наличия крахмала. Для увеличения вязкости (густоты) молока к нему добавляют крахмал или муку. Определение крахмала или муки, добавленных в молоко, основано на реакции йода с крахмалом, который окрашивается под действием йода в синий цвет. Приборы и реактивы: пробирки, пипетки вместимостью 5 см³, капельница, спиртовой раствор йода. Проведение анализа. В пробирке смешивают 5 см³ молока и 3 капли спиртового раствора йода и устанавливают наличие изменения окраски: в присутствии крахмала молоко окрасится в синий цвет, без крахмала - в бледно-желтый. 8. Установление наличия двухромовокислого калия. Для консервирования молока может быть использован хромпик – К₂Cr₆O₇. Такое молоко непригодно к употреблению и для переработки. Приборы и реактивы: пробирки, пипетки вместимостью 5 см³, 2%-ный раствор азотнокислого серебра. Проведение анализа. В пробирку наливают 2-3 см³ молока и добавляют равное количество 2%-ного раствора азотнокислого серебра. Появление желтого или красновато-желтого окрашивания свидетельствует о наличии в молоке двухромовокислого калия. Тема №11. Установление потенциально опасных веществ в молоке К потенциально опасным веществам, содержание в молоке которых не допускается, или строго лимитировано, относятся:- токсические элементы (свинец, мышьяк, кадмий и ртуть);- микотоксины (афлатоксин М₁);- антибиотики;- пестициды (изомеры гексхлорциклогексана и ДДТ с его метаболитами);- радионуклиды (цезий-137 и стронций-90).Допустимые уровни вышеперечисленных потенциально опасных веществ указаны в Приложении (таблица 9).