Тема №. 12. Способы контроля пастеризации молока. Определение технологических свойств молока.

Ферменты молока (пероксидаза, фосфатаза, каталаза, липаза) имеют четко определенный температурный минимум, при котором происходит их инактивация. Этими свойствами ферментов пользуются при контроле эффективности пастеризации молока и для выявления молока, подвергшегося термической обработке (если это не указано в сопроводительной документации, такое молоко будет считаться фальсифицированным). Наибольшее значение для этих целей имеют пероксидаза и фосфатаза, вырабатываемые соматическими клетками вымени.

Определение качества пастеризации осуществляется согласно ГОСТ 3623-73 «Молоко и молочные продукты. Методы определения пастеризации».

1. Методы определения пероксидазы. Пероксидаза инактивируется при температуре пастеризации не ниже 80°С с выдержкой 20-30 с.

1.1. Метод определения пероксидазы по реакции с солянокислым парафенилендиамином.

Метод основан на разложении перекиси водорода ферментом пероксидазой, содержащейся в молоке и молочных продуктах. Освобождающийся при разложении перекиси водорода актив­ный кислород окисляется парафенилендиамин, образуя соединение синего цвета.

Приборы и реактивы: весы лабораторные аналитические; пробирки, пипетки вместимостью 2, 5 и 10 см³, капельницы из темного стекла или покрытые черным лаком; колбы мерные вместимостью 250 и 500 см³, колбы конические вместимостью 250 см³, баня водяная с нагревательным прибором;

парафенилендиамин солянокислый, 2%-ный водный раствор. Раствор нестойкий, его следует хранить в склянке из темного стек­ла с плотно закрытой пробкой, в темном, прохладном месте; кислота лимонная кристаллическая, кислота серная, концентрированная; калий марганцовокислый, 0,1N раствор; перекись водорода, 0,5%-ный раствор; натрий фосфорнокислый двузамещенный  кристаллический.

Приготовление буферной смеси. 97 г двузамещенного фосфорнокислого натрия и 0,65 г лимон­ной кислоты, взвешенных с погрешностью не более 0,0002 г, раст­воряют дистиллированной водой в мерной колбе вместимостью 500 см³, доливают до метки и перемешивают. Буферную смесь следует сохранять в склянке из темного стекла плотно закрытой пробкой.

 

Проведение анализа.

В пробирку отмеривают или отвешивают анализируемый продукт и дистиллированную воду.

Количество дистиллированной воды и анализируемого продук­та должно соответствовать указанному в табл. 20.

 

 

Таблица 20

Наименование продукта	Количество продукта	Количество дистиллированной воды
Молоко пастеризованное	5  см^3	-
Сливки	2-3  см^3	2-3
Сметана	2-3 г	2-3
Кисломолочные напитки (кефир, ацидофильное молоко, ацидофилин, кумыс); простокваша	5 см^3	-
Белковые продукты (творог, паста)	2-3 г	2-3
Сливочное масло	2-3 см^3	2-3

 

Для получения 2-3 см³плазмы масла 50 г сливочного масла расплавляют при температуре не выше 50°С, затем охлаждают и застывший слой жира удаляют.

После добавления воды анализируемые продукты тщательно растирают стеклянной палочкой.

Затем в пробирку с указанным количеством продукта и воды приливают 2,5 см³буферной смеси, тщательно перемешивают стек­лянной палочкой и помещают в водяную баню с температурой во­ды 35±2°С, где выдерживают 3-5 мин, чтобы содержимое про­бирки приняло эту температуру. Затем добавляют 6 капель 0,5% -го раствора перекиси водорода и 3 капли раствора парафенилендиамииа солянокислого, перемешивают вращательными движения­ми содержимое пробирки после добавления каждого реактива. После этого снова помещают пробирку в водяную баню и наблю­дают изменение окраски жидкости.

При отсутствии фермента пероксидазы в молоке и молочных продуктах цвет содержимого пробирки не изменяется. Следова­тельно, молоко и молочные продукты подвергались пастеризации при температуре не ниже 80°С.

При наличии пероксидазы в молоке, сливках, сливочном масле содержимое пробирок приобретает темно-синее окрашивание. При наличии пероксидазы в кисломолочных продуктах и кислосливочном масле содержимое пробирок приобретает серо-фиолетовый цвет, постепенно переходящий в темно-синее окрашивание. Следо­вательно, молоко и молочные продукты не подвергались пастери­зации или подвергались пастеризации при температуре ниже 80°С, или были смешаны с непастеризованными продуктами. Чувстви­тельность метода позволяет обнаружить добавление не менее 5% непастеризованных молочных продуктов к пастеризованным.

1.2. Определение пероксидазы по реакции с йодистокалиевым крахмалом.

Метод основан на разложении перекиси водорода ферментом пероксидазой, содержащейся в молоке и молочных продуктах. Ос­вобождающийся при разложении перекиси водорода активный кислородом окисляет йодистый калий, освобождая йод, образующий с крахмалом соединение синего цвета.

Приборы и реактивы: приборы - как в предыдущей методике;

перекись водорода, 0,5%-ный раствор; крахмал картофельный; калий йодистый, вода дистиллированная.

Приготовление йодистокалиевого крахмала

3 г крахмала взвешивают с погрешностью не более 0,01 г и смешивают с 5—10 мл дистиллированной холодной воды до по­лучения однородной массы. Отдельно в колбе доводят до кипения 100 см³ дистиллированной воды и при непрерывном помешивании приливают воду к разведенному крахмалу, не допуская образова­ния комков. Полученный раствор доводят до кипения. После ох­лаждения к раствору крахмала прибавляют 3 г йодистого калия, Перемешивания до растворения кристаллов йодистого калия.

Раствор йодистокалиевого крахмала является нестойким реак­тивом, поэтому приготовлять его следует в небольшом количестве и сохранять в теплом прохладном месте не более двух дней.

Допускается вместо йодистокалиевого крахмала приме­нять отдельно приготовленный 1%-ный раствор крахмала и 10%-йый раствор йодистого калия.

 

Проведение анализа.

Отмеривание или взвешивание анализируемых продуктов и во­ды и подготовку плазмы масла производят по предыдущей методике.

В пробирку с указанным количеством продукта и воды приливают 5 капель раствора йодистокалиевого крахмала и 5 капель 0,5%-ного раствора перекиси водорода, вращательными движениями перемешивают содержимое пробирки после добавления каждого реактива. Затем определяют наличие пероксидазы по изменению окраски.

Если применяют отдельно раствор крахмала и йодистого калия, то поступают следующим образом: в каждую пробирку с продуктами приливают 0,5 см³ 1%-ного раствора крахмала, 2 капли 10%-ного раствора йодистого калия и 5 капель 0,5%-ного раствора перекиси водорода, перемешивают содержимое пробирок после добавления каждого реактива, затем определяют наличие пероксидазы по изменению окраски.

При отсутствии фермента пероксидазы в молоке и молочных продуктах цвет содержимого пробирок не изменится. Следовательно, молоко и молочные продукты подвергались пастеризации при температуре не ниже 80°С.

При наличии пероксидазы в молоке, сливках, сливочном масле содержимое пробирок приобретает темно-синее окрашивание. При наличии пероксидазы в кисломолочных продуктах и кислосливочном масле содержимое пробирок не более чем через 2 мин приобретает серовато-синюю окраску, постепенно переходящую в темно-синюю. Следовательно, молоко и молочные продукты не. подвергалось пастеризации или подвергались пастеризации при температуре ниже 80°С или были смешаны с непастеризованными молочными продуктами. Появление окраски в пробирках более чем через 2 мин после добавления йодистокалиевого крахмала и перекиси водорода не указывает на отсутствие пастеризации, так как может вызываться разложением реактивов.

Чувствительность метода позволяет обнаружить добавление не менее 5% непастеризованных молочных продуктов к пастеризованным.

2. Методы определения фосфатазы.

Фосфатаза инактивируется при температуре пастеризации не ниже 63°С с выдержкой 30 мин.

2.1. Определение фосфатазы по реакции  с фенолфталеинфосфатом натрия.

Метод основан на гидролизе фенолфталеинфосфата натрия ферментом фосфатазой, содержащейся в молоке и молочных про­дуктах. Освобождающийся при гидролизе фенолфталеин в щелоч­ной среде дает розовое окрашивание.

Приборы и реактивы: приборы по предыдущей методике; аммиак водный; 1N раствор аммония хлористого; смесь буферная аммиачная; фенолфталеинфосфат натрия 0,1 %-ный раствор; пробирки стеклянные с нанесенными метками на объем 2 мл; пипетки измерительные вместимостью 1 и 2 мл; пробки резиновые.

Приготовление аммиачной буферной смеси

80 см³ I N раствора аммиака смешивают с 20 см³ 1 N раствора хлористого аммония (рН 9,8).

Приготовление 0,1%-ного раствора фенолфталеинфосфата натрия.

0,1 г порошкообразного фенолфталеипфосфата натрия, взвешенного с погрешностью не более 0,0002 г, растворяют в мерной колбе вместимостью 100 см³ с небольшим количеством буферной смеси, затем доливают буферную смесь до метки и перемешивают.

Проведение анализа

В пробирку отмеривают анализируемый продукт, дистиллированную воду и реактив. Количество анализируемого продукта, дистиллированной воды и реактива должно соответствовать указан­ному в табл. 21.

Таблица 21

 

Наименование продуктов	Количество продукта, см^3	Количество дистиллированной воды, см^3	Количество раствора фенолфталеинфосфата натрия, см^3
Молоко пастеризованное	2	-	1
Сливки	2	2	1
Кисломолочные напитки(кумыс, йогурт)	2	2	2
Простокваша	2	2	2

 

После добавления дистиллированной воды и реактива содержимое пробирки закрывают пробкой и взбалтывают,

Затем пробирку помещают в водяную баню с температурой воды от 40 до 45°С и определяют окраску содержимого пробирки через 10 мин и через 1 ч.

При отсутствии фермента фосфатазы в молоке и молочных продуктах окраска содержимого пробирки не изменяется. Следовательно, молоко и молочные продукты подвергались пастеризации при температуре не ниже 63°С. При наличии фосфатазы в мо­локе и молочных продуктах содержимое пробирки приобретает окраску от светло-розовой до ярко-розовой.

Следовательно, молоко и молочные продукты не подвергались пастеризации или подвер­гались пастеризации при температуре ниже 63°С, или были смешаны с непастеризованными продуктами.

Чувствительность метода позволяет обнаружить добавление не менее 2% непастеризованных молочных продуктов к пастеризованным.

2.2. Определение фосфатазы с 4-аминоантипирином
 (арбитражный метод)

Метод основан на гидролизе динатриевой соли фенилфосфорной кислоты ферментом фосфатазой, содержащейся в молоке и молочных продуктах. Выделившийся при гидролизе свободный фенол в присутствии окислителя даст розовое окрашивание с 4-аминоантипирином.

Приборы и реактивы: весы лабораторные аналитические;весы лабораторные технические; пробирки стеклянные; пипетки измерительные по 5 см³; ступка фарфоровая с пестиком; колба коническая 100 см³; цилиндр стеклянный на 25 см³; баня водяная; аммоний хлористый.; аммиак водный; фенилфосфорной кислоты динатриевая соль двуводная; 4-аминоантипирин; цинк сернокислый; медь сернокислая; эфир этиловый; вода дистиллированная.

Приготовление основного буферного раствора (рН 0±0,2)

40 г хлористого аммония (NH4CI), взвешенного с погрешностью не более 0,01 г, растворяют в 100-200 см³ дистиллированной воды, добавляют 348 см³ 25%-ного водного аммиака (<NH4OH) и доводят до 1 л дистиллированной водой.

Приготовление субстрата

Приготовление раствора А:

1,25 г динатриевой соли фенилфосфорной кислоты (C₆H₅O₄PNa₂) взвешивают с. погрешностью не более 0,0002 г, растворяют в 100 см³ основного буферного раствора,

Приготовление раствора Б:

0,8 г 4-аминоантнпирина (C₁₁H₁₁ON₂NН₂), взвешенного с погрешностью не более 0,0002 г, растворяют в 900 см³ дистиллированной воды.

Растворы А и Б должны быть бесцветными и храниться в склянках из темного стекла в холодильнике. Срок хранения не более 1 мес. Пожелтевшие растворы для работы непригодны.

Рабочий раствор субстрата готовят непосредственно перед определением реакции смешиванием растворов А и Б (1: 9). Рабочий раствор пригоден для работы в течение 8 ч при хранении его в склянке из темного стекла.

Приготовление осадителя системы цинк-медь: 30 г сульфата цинка (ZnSО₄H₂О) и 6 г сульфата меди (CuSО_4*5H₂О), взвешенных с погрешностью не более 0,01 г, растворяют в 1 л дистиллированной воды.

Проведение анализа.

К 3 см³ анализируемого продукта (молоко, сливки, кисломолочные напитки, простокваша и предварительно подготовленные для анализа творог, сметана) добавляют 2 см³ рабочего раствора субстрата. Затем перемешивают содержимое пробирки и ставят в водяную баню, нагретую до 40-45°С на 30 мин. В пробирку, вынутую из водяной бани, добавляют 5 см³ осадителя системы цинк-медь, тщательно перемешивают содержимое пробирки и снова ставят в водяную баню с температурой 40-45°С на 10 мин. Вынув пробирку из бани, производят визуальное сравнение содержимого пробирки испытуемого продукта с контрольным опытом.

Контрольным опытом для всех продуктов является аналогичная реакция с кипяченым молоком. Если контрольный опыт с кипяченым молоком дает слабо-розовое окрашивание — динатрий фенилфосфат подлежит дополнительной очистке.

При отсутствии фермента фосфатазы в молоке и молочных продуктах окраска содержимого пробирки (раствора, отделившегося от осажденного белка) бесцветная, т. е. аналогичная содержимому пробирок контрольного опыта. Следовательно, молоко и молочные продукты подвергались пастеризации при температуре не ниже 63°С.

При наличии фосфатазы в молоке и молочных продуктах содержимое пробирок (раствор) имеет окрашивание от розового до темно-красного цвета. Следовательно, молоко и молочные продукты не подвергались пастеризации или подвергались пастеризации при температуре ниже 63°С или были смешаны с непастеризованными молочными продуктами.