Определение бактериальной загрязненности молока

Санитарно-микробиологическое состояние молочных продуктов, а также различных объектов внешней среды оценивают, как правило, по косвенным микробиологическим показателям, позволяющим судить о возможном обсеменении их патогенными микроорганизмами.

К таким показателям относят общую бактериальную обсемененность, выраженную показателем КОЕ (колониеобразующие единицы), и наличие санитарно-показательных микроорганизмов.

1. Общая бактериальная обсемененность (аэробные и факультативно-анаэробные мезофильные микроорганизмы). Принято считать, что чем выше микробная обсемененность объекта, тем выше вероятность присутствия в них патогенных микробов. Общую бактериальную обсемененность выражают показателем КОЕ, который характеризует количество колоний микроорганизмов, которые вырастают на питательном агаре с гидролизованным молоком при посеве 1 см³ или 1 г продукта или субстрата и культивировании посевов при 30°С в течение 72 ч.

При определении КОЕ образуются колонии аэробных и факультативно-анаэробных мезофильных микроорганизмов. Это в основном представители сапрофитной микрофлоры. Показатель общей микробной обсемененности значительно меньше, чем истинное количество микроорганизмов в исследуемом объекте. Это объясняется тем, что при высеве на агаре не дают роста мертвые клетки, а также клетки, утратившие способность к размножению, анаэробные микроорганизмы, термофилы и психрофилы, многие представители патогенной микрофлоры и молочнокислые бактерии, не растущие на обычных питательных средах. Кроме того, не учитываются плесени и актиномицеты, рост которых можно обнаружить только на 4-е сутки. Необходимо также иметь в виду, что не всегда разбиваются бактериальные конгломераты, и одна колония вырастает из нескольких клеток.

Определение общей бактериальной обсемененности осуществляется согласно ГОСТ 9225-84 «Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа».

Пробы для микробиологических исследований отбирают в стерильную посуду, которую закрывают стерильными пробками, горлышко посуды и пробку обертывают бумагой и обвязывают. Отобранные пробы необходимо исследовать не позднее 4 ч с момента отбора, при условии хранения и транспортирования при температуре не выше +6°С.

Предложено два основных метода определения бактериальной обсемененности: посев в бактериологические чашки и редуктазная проба, которая является косвенным показателем микробного загрязнения молока.

Редуктазная проба.

1.1. Метод с метиленовым синим (арбитражный). По продолжительности обесцвечивания реактива оценивают бактериальную обсемененность молока.

Время наступления обесцвечивания содержимого пробирки связано с количеством микроорганизмов в молоке, вырабатывающих фермент редуктазу. Редуктаза обладает способностью обесцвечивать ряд органических красителей (метиленовую синь, резазурин).

Приборы и реактивы: редуктазник или водяная баня с терморегулятором, пробирки диаметром 20 мм и высотой 180 мм, пипетки вместимостью 1 и 20 см³, рабочий раствор метиленового синего (готовится из основного).

Основной раствор: 10 г. метиленового синего смешивают со 100 см³ 96%-ного этилового спирта. Раствор помещают в термостат при 37°С на 24 часа, а затем фильтруют.

Рабочий раствор: к 5 мл насыщенного спиртового раствора прибавляют 195 мл дистиллированной воды, тщательно перемешивают. Срок хранения – не более 7 суток.

Проведение анализа. В стерильные пробирки наливают по 1 см³ рабочего раствора метиленового синего и по 20 см³ исследуемого молока, закрывают резиновыми пробками и смешивают путем медленного трехкратного переворачивания пробирок. Пробирки помещают в редуктазник; вода в редуктазнике должна доходить до уровня жидкости в пробирке. Наблюдение за изменением окраски ведут через 40 мин, 2,5 и 3,5 ч с начала проведения анализа. Окончанием анализа считают момент обесцвечивания окраски молока.

В зависимости от продолжительности обесцвечивания молоко относят к одному из 4-х классов (табл. 8).

Таблица 8

Определение бактериальной обсемененности и класса молока по

 редуктазной пробе с метиленовым синим

Класс молока	Продолжительность обесцвечивания, ч.	Ориентировочное количество бактерий в 1см^3 молока, КОЕ
Высший	Более 3,5	До 300 тыс.
I	3,5	От 300 тыс. до 500 тыс.
II	2,5	От 500 тыс. до 4 млн.
III	40 мин.	От 4 млн. до 20 млн.

 

1.2. Метод с резазурином. По продолжительности изменения окраски резазурина оценивают бактериальную обсемененность сырого молока.

Приборы и реактивы: приборы и посуда те же, рабочий раствор резазурина (готовится из основного).

Основной раствор: 100 мг резазурина растворяют в 200 см³ прокипяченной и озлажденной дистиллированной воды. Срок хранения не более 20 сут. при 3-5°С.

Рабочий раствор готовят из основного разбавлением прокипяченной и охлажденной дистиллированной водой в соотношении 1:10. Срок хранения не более 7 сут.

Проведение анализа. В пробирки наливают по 1 см³ рабочего раствора резазурина и по 10 см³ исследуемого молока, закрывают резиновыми пробками и трехкратно перемешивают. Пробирки помещают в редуктазник при 37°С. Вода после погружения пробирок должна доходить до уровня жидкости в пробирке или быть немного выше. Момент погружения считают началом анализа. По истечении 1 ч. пробирки вынимают из редуктазника и определяют окрашивание молока. Пробирки, имеющие сиреневую окраску, оставляют в редуктазнике еще на 30 мин. В зависимости от обесцвечивания или изменения цвета молоко относят к одному из 4-х классов (табл. 9).

Таблица 9

Определение бактериальной обсемененности и класса молока

по редуктазной пробе с резазурином

Класс молока	Время обесцвечивания, ч.	Окраска молока	Ориентировочное количество бактерий в 1см^3 молока, КОЕ
Высший	1,5	Серо-сиреневая до сиреневой со слабым серым оттенком	До 300 тыс.
I	1	Серо-сиреневая до сиреневой со слабым серым оттенком	От 300 тыс. до 500 тыс.
II	1	Сиреневая с розовым оттенком или ярко розовая	От 500 тыс. до 4 млн.
III	1	Бледно-розова или белая	От 4 млн. до 20 млн.

 

2. Метод посева в бактериологические чашки основан на способности мезофильных анаэробных микроорганизмов размножаться на питательном плотном агаре при 30±1°С в течение 72 ч.

Приборы и реактивы: термостат; стерильная посуда: чашки Петри, пробирки диаметром 21 мм, пипетки объемом 1 см³, пробки, штативы; физиологический раствор, питательная среда (агар).

Проведение анализа. Стерильной пипеткой отбирают 1 см³ исследуемой пробы молока, переносят в пробирку с 9 см³ стерильного физиологического раствора (разведение 1:10). Из этого разведения другой стерильной пипеткой 1 см³ переносят во вторую пробирку, также содержащую 9 см³ физиологического раствора (разведение 1:100). Таким же путем делают последовательные разведения 1:1000, 1: 10 000, 1:100 000, 1:1000 000.

Каждое из последних трех разведений засевают в количестве 1 см³ в чашки Петри с заранее маркированными крышками и заливают 10-15 см³ расплавленной и охлажденной до 40-45°С питательной средой. Содержимое чашек тщательно перемешивают путем легкого вращательного покачивания. После застывания агара чашки Петри переворачивают крышками вниз и ставят в термостат на 72 ч.

Затем чашки просматривают. Количество выросших колоний подсчитывают на каждой чашке, поместив ее вверх дном на темном фоне. Каждую подсчитанную колонию отмечают на дне чашки чернилами. При большом количестве колоний и равномерном их распределении дно чашки делят на одинаковые сектора и подсчитывают число колоний в 2-3-х секторах, находят среднее арифметическое и умножают на количество секторов.

Общее количество бактерий в 1 см³ вычисляют по формуле:

X= nx10m,

Где n – количество колоний; m – число десятикратных разведений.

 

Согласно ФЗ «Технический регламент на молоко и молочную продукцию», разным сортам молока сырого соответствует следующая бактериальная обсемененность, в КОЕ/см³:

- высшего сорта – 1х10⁵

- первого сорта – 5х10⁵

- второго сорта – 4х10⁶.