Определение массовой доли белка в молоке методом кьелдаля.

Данный метод является универсальным. Сущность его заключается в переводе путем минерализации азота аминокислот в аммиак с последующим его количественным определением и пересчетом на белок. Установив процентное содержание азота в исследуемом объекте, пересчитывают полученные результаты на содержание белков путем умножения на соответствующий коэффициент. Этот коэффициент получают исходя из содержания в белках общего азота (для молока – 6,38).

При определении общего азота органическое вещество сжигают концентрированной серной кислотой (мокрое озоление). Органическое вещество распадается, окисляясь до углекислого газа и воды. Азот при этом превращается в аммиак, который образует с серной кислотой аммонийную соль. После сжигания аммонийную соль разлагают щелочью, а выделяющийся аммиак поглощают борной кислотой. Тетраборат аммония титруют раствором соляной кислоты и рассчитывают количество азота в навеске, подвергшейся сжиганию, а затем и во всем препарате.

Для ускорения сжигания применяют катализаторы: пероксид водорода, сульфат меди, а для повышения температуры сжигаемой смеси добавляют сульфат калия.

Приборы и реактивы: пробирки, колбы мерные на 250, 500 и 1000 см³, колбы Кьелдаля на 100 и 500 см³, каплеуловитель, холодильник стеклянный лабораторный с прямой трубкой, трубка с предохранительным шаром (пипетка Гемпеля), колба коническая на 250 см³, бюретки прямые с краном на 50 см³; серная кислота (концентрированная), 40%-ный раствор гидроокиси натрия, сульфат меди, сульфат калия, 30%-ный раствор перекиси водорода, 4%-ный раствор борной кислоты, раствор соляной кислоты 0,2 моль/дм³, растворы индикаторов.

Приготовление смеси солей: смешивают 100 г сульфата калия с 0,4 г сернокислой меди, смесь измельчают в ступке.

Приготовление раствора смешанного индикатора. Основной раствор: 100 см³ 0,1%-ного спиртового раствора метилового красного смешивают с 25см³  0,1%-ного раствора метиленовой сини. Рабочий раствор: 1 объем основного раствора смешивают с 1 объемом спирта и 2 объемами воды.

Проведение анализа. В колбу Кьелдаля помещают несколько бусинок или кусочков фарфора и 10 г смеси солей. В бюксу (или стаканчик) отмеривают 1 см³ молока, закрывают крышкой и взвешивают. Молоко из бюксы осторожно переливают в колбу Кьелдаля. Пустую бюксу вновь взвешивают и по разнице устанавливают массу взятого на анализ молока. В колбу добавляют 10 см³ концентрированной серной кислоты, вливая ее осторожно по стенкам колбы, смывая с них капли молока, затем 10 см³ перекиси водорода или 0,5 г перманганата калия. Колбу закрывают стеклянной пробкой и осторожно круговыми движениями перемешивают содержимое.

Колбу ставят на нагревательный прибор в наклонном положении под углом 45°С и осторожно нагревают. Нагревание колбы продолжают до тех пор, пока не прекратится пенообразование, и содержимое колбы не станет жидким. Затем сжигание продолжают при более интенсивном нагревании. Степень нагревания считают достаточной, когда кипящая кислота конденсируется в середине горловины колбы Кьелдаля. Периодически содержимое колбы перемешивают, смывая обуглившиеся частицы со стенок колбы. Нагревание продолжают до тех пор, пока жидкость станет совершенно прозрачной и практически бесцветной или голубоватой.

Затем колбу с содержимым охлаждают до комнатной температуры, добавляют в нее 20 см³ дистиллированной воды и тщательно перемешивают круговыми движениями до растворения осадка.

В коническую приемную колбу отмеривают 20 см³ раствора борной кислоты, добавляют 2 капли индикатора и перемешивают. Раствор окрашивается в фиолетовый цвет. Колбу соединяют с холодильником с помощью аллонжа и резиновой пробки так, чтобы конец аллонжа был ниже поверхности раствора борной кислоты в колбе. Колбу Кьелдаля соединяют с холодильником с помощью каплеуловителя, проходящего через пробку с делительной воронкой. В мерном цилиндре отмеривают 50 см³ раствора гидроксида натрия и через делительную воронку вносят его в колбу и сразу перекрывают кран во избежание потери образующегося аммиака. Содержимое колбы Кьелдаля осторожно перемешивают круговыми движениями и нагревают до кипения. Выделяющийся аммиак через холодильник поступает в приемную колбу с борной кислотой. Продолжают перегонку до тех пор, пока жидкость не начнет булькать. При этом регулируют степень нагрева так, чтобы время дистилляции было не менее 20 мин. Убедиться в полноте перегонки аммиака можно путем перегонки в новую порцию борной кислоты (20 см³) в течение 5 мин. Окраска раствора борной кислоты должна остаться без изменения.

Перед окончанием перегонки опускают коническую колбу так, чтобы конец аллонжа был над поверхностью раствора борной кислоты, и продолжают перегонку в течение 1-2 мин.

После прекращения нагревания отсоединяют аллонж. Ополаскивают внешнюю и внутреннюю поверхности аллонжа дистиллированной водой, сливая ее в коническую колбу.

Дистиллят титруют раствором соляной кислоты до перехода зеленого цвета в серый. При избытке титранта раствор приобретает фиолетовый цвет.

Параллельно проводят контрольный опыт в том же порядке, используя вместо молока 5 см³ дистиллированной воды.

Массовую долю общего азота (%) вычисляют с точностью до третьего десятичного знака по формуле:

 

N_общ = 1,4 х с х (V ₁ – V ₀)

                    m

где с – концентрация растворов соляной кислоты, моль/дм³;

V₁, V₀ – объем кислоты, израсходованной на титрование в рабочем и контрольном опытах, см³;

m – масса молока, взятого на анализ.

 

Содержание белка Б (%) в молоке определяют путем умножения количества общего азота на коэффициент 6,38:

Б= N_общ х 6,38

 

Определение общего количества белка в молоке методом формольного титрования Метод основан на взаимодействии аминогрупп белков с формалином. Его используют для контроля массовой доли белка в молоке кислотностью не более 22°Т. При анализе молока с повышенной кислотностью этот метод дает завышенные результаты. Консервирование проб молока не допускается. Методом формольного титрования определяют содержание в молоке общего количества белка для целей контроля состава молока, нормализации его при выработке сыра и творога, установления расхода молока на выработку продукции. В процессе реакции с формалином аминогруппа белка теряет свои основные свойства. Образующаяся метиламиновая кислота оттитровывается 0,1N раствором NaOH. Количество титруемых карбоксильных групп эквивалентно количеству связанных формалином аминных групп. В ходе анализа проделывают не менее двух параллельных определений. Допускается расхождение при титровании между двумя параллельными анализами 0,05 мл NaOH. Приборы и реактиы: пипетки на 20 и 50 см³, пипетки градуированные 1 и 5 см³, стаканы или колбы химические на 150-200 см³, бюретка для титрования на 25 см³, гидроксид натрия 0,1 н. и 40%-ный растворы, приготовленные на прокипяченной дистиллированной воде, 2%-ный спиртовой раствор фенолфталеина, 37-40%-ный раствор формалина (нейтрализованный), 2,5%-ный раствор сульфата кобальта, прокипяченная дистиллированная вода. Приготовление эталона окраски. В колбу для титрования отмеривают 20 см³ молока и добавляют 0,5 см³ 2,5%-ного раствора сульфата кобальта. Проведение анализа. В колбу пипеткой отмеривают 20 см³ молока и 0,25 см³ (10-12 капель) раствора фенолфталеина. Смесь оттитровывают 0,1 N раствором NaOH из бюретки до слабо-розовой окраски, соответствующей эталону.После титрования в колбу вносят 4 см³ нейтрализованного (свежеприготовленного) 40%-ного раствора формалина и через минуту вторично оттитровывают 0,1 N раствором NaOH до появления слабо-розовой окраски такой же интенсивности, как и при первом титровании. Массовая доля (%) общего количества белка в молоке равна количеству миллилитров 0,1 N раствора NaOH, израсходованного на титрование в присутствии формалина, умноженному на коэффициент 0,959. Б=0,959 х Nгде N – количество 0,1N раствора NaOH, пошедшего на титрование. Пользуясь таблицей 12, можно определить содержание общего белка в молоке при разном количестве 0,1 N раствора NaOH, пошедшего на титрование в присутствии формалина.Таблица 12Содержание общего белка в молоке по результатам титрования в присутствии формалина Расход 0,1N рас-   % белка в Расход 0,1N раствора  % белка молокетвора NaOH (мл)  молоке       NaOH (мл)  2,5                       2,40             3,3                 3,16 2,6                       2,49             3,4                 3,26 2,7                       2,59             3,5                 3,35 2,8                       2,69             3,6                 3,45 2,9                       2,78             3,7                 3,55 3,0                       2,88             3,8                 3,65 3,1                       2,98             3,9                 3,74 3,2                       3,07             4,0                 3,84 Рефрактометрический метод определения общего количества белка в молоке Данный экспресс-метод основан на определении разности показателей преломления исследуемого молока и выделенной из него безбелковой сыворотки. Им можно исследовать молоко сырое и пастеризованное, консервированное формалином и с повышенной кислотностью (до 30°Т). Приборы и реактивы: рефрактометр (типа АМ-2 и ИРФ-464), водяная баня закрытого типа, электроплитка, центрифуга молочная, пипетки на 5 см³, флаконы для лекарственных средств вместимостью 10 см³, 4%-ный раствор кальция хлористого, вода дистиллированная. Проведение анализа. В 3 флакона отмеривают по 5 см³ молока и добавляют по 6 капель раствора хлорида кальция. Флаконы закрывают пробками и перемешивают содержимое. Затем их помещают на водяную баню так, чтобы уровень воды достигал половины высоты флаконов, закрывают крышкой, доводят до кипения и кипятят не менее 10 мин. Не открывая бани, сливают воду через отверстия в крышке и наливают холодную воду для охлаждения. Флаконы встряхивают и разрушают образовавшийся белковый сгусток. После этого их помещают в центрифугу и центрифугируют не менее 10 мин. Образовавшуюся прозрачную сыворотку отбирают пипеткой и наносят 1-2 капли на измерительную призму рефрактометра. Закрывают измерительную призму осветительной и снимают показания оптической плотности сыворотки (Б_с) по шкале «Белок» не менее 3 раз и вычисляют среднее арифметическое. Удаляют сыворотку с призмы рефрактометра, промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой.Помещают на измерительную призму 2 капли исследуемого молока и также снимают показания оптической плотности (Б_м) по шкале «Белок» не менее 3 раз.Массовую долю белка в молоке Б (%) вычисляют по формулеБ= Б_м - Б_с,Например, если показатель молока, определенный с помощью рефрактометра АМ-2, равен 8,4, а сыворотки 5,2, то процентное содержание белка в исследуемом молоке равен 8,4-5,2=3,2%. Колориметрический метод определения массовой доли белка в молоке. Метод основан на способности белков молока при рН ниже изоэлектрической точки связывать кислые красители (амидо-черный) вследствие образования нерастворимого комплекса. При этом интенсивность окраски раствора уменьшается пропорционально количеству белка. Для осуществления метода используют универсальные фотоколориметры типа КФК (2М, 3М, 5М), СФ-16 со светофильтрами для выделения спектральной области 590-600 нм. Приборы и реактивы: весы лабораторные, рН-метр лабораторный, центрифуга лабораторная на 1000 об/мин, баня водяная с температурой 60-80°С, термометр ртутный, кюветы кварцевые рабочей длины 10 мм, стаканчики химические 50 и 100 см³, пробирки центрифужные стеклянные, фильтры бумажные (розовая лента), пипетки на 1,2 и 20 см³, колбы мерные вместимостью 200 и 2000 см³, колбы химические 500 и 750 см³, раствор сине-черного красителя в цитратной буферной смеси (рН 2,3) Приготовление реактивов. Реактив 1 (буферный раствор). Взвешивают 31,7 г лимонной кислоты и 8,4 г 12-водного или 3,4 безводного ортофосфата натрия. Реактивы помещают в колбу и добавляют в нее 400 см³ дистиллированной воды. Содержимое нагревают до температуры около 70°С до полного растворения и охлаждают до 20°С. Реактив 2 (раствор красителя). Навеску 4,6 г красителя (амидо-черный 10Б) помещают в колбу и добавляют в нее 200 см³ воды, нагревают до70°С и перемешивают до растворения красителя. Раствор отфильтровывают через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 2000 см³. Фильтр промывают водой до удаления следов красителя. Затем в эту колбу переносят реактив 1. Содержимое колбы охлаждают и доливают до метки водой, закрывают резиновой пробкой и перемешивают содержимое. Если рН раствора не соответствует 2,3±0,1, то добавляют, соответственно, концентрированную серную кислоту или гидроксид натрия. Проведение анализа. В стеклянную центрифужную пробирку пипеткой вносят 1 см³ молока, приливают 20 см³ красителя, закрыв пробирку резиновой пробкой, перемешивают от 2 до 10 раз, не встряхивая. Пробирку помещают в центрифугу и центрифугируют 20 мин. Затем отбирают пипеткой 1 см³ надосадочной жидкости, помещают в мерную колбу вместимостью 50 см³, доливают до метки дистиллированной водой и перемешивают. Аналогичным способом разбавляют буферный раствор красителя в 50 раз. Он должен иметь оптическую плотность 0,82±0,02. Если она не соответствует данному значению, то добавляют буферный раствор или раствор красителя.На фотоэлектроколориметре или спектрофотометре в кювете длиной 10 мм при 590-600 нм измеряют оптическую плотность разбавленного раствора красителя по отношению к разбавленной надосадочной жидкости.Массовую долю белка (%) вычисляют по формулеБ=7,78 х D – 1,34где D – оптическая плотность.7,78 и 1,34 – эмпирические коэффициенты. Использование экспресс-анализаторов для определения содержания белка и жира в молоке.

Производство продукции гарантированного качества невозможно без применения современных высокоэффективных методов контроля показателей качества. При этом используемые методы измерения должны быть не только точными и воспроизводимыми, но и экспрессными, позволяющими проводить оперативный анализ при контроле на производстве. Особенно важным этот аспект становится при реализации молока от частного производителя через сеть продовольственных рынков, т.к. у специалиста государственной лаборатории ветеринарно-санитарной экспертизы для анализа партии молока имеется достаточно ограниченный отрезок времени. Для такого оперативного и достаточно точного экспресс-анализа современная промышленность предлагает ряд приборов-анализаторов качественного состава молока. Приведем некоторые примеры.

1. Инфракрасные (ИК) анализаторы молока и молочных продуктов. Принцип их действия основан на степени измерения поглощения инфракрасного излучения компонентами молока. Во многих странах мира, в том числе и в России, для оперативного анализа широко применяется метод спектроскопии в ближней и средней инфракрасной области, ИК-спектроскопия. В молочной промышленности ИК-спектроскопия активно используется для определения химического состава (жир, белок, лактоза, лимонная кислота, казеин и т. д.) и физико-химических свойств (плотность, рН, точка замерзания и т. д.), при входном контроле сырья и производственном контроле. При использовании такого оборудования появилась возможность контроля качества молока и молочных продуктов без сложной «пробоподготовки», что значительно ускоряет и упрощает анализ. Примерами анализаторов этого типа могут служить приборы LactoScope (LactoScope Filter – модель C3+, LactoScope Filter – модель C4+, LactoScope FTIR Advanced), «Милко-Скан», отечественный прибор «Ирма-11».

2. Ультразвуковые анализаторы качества молока. Принцип их действия основан на измерении скорости распространения ультразвука в молоке при двух разных температурах. Наиболее востребованными и доступными в РФ стали анализаторы следующих марок:

 «Лактан 1-4». Помимо определения массовой доли белка, жира, добавленной воды, СОМО и плотности, «Лактан 1-4» обладает возможностью определения точки замерзания в пробе цельного свежего молока, консервированного, пастеризованного, нормализированного, обезжиренного, восстановленного молока и молока длительного хранения. Среднее время измерения составляет всего 90 секунд.

 «Клевер 1М»: позволяет определять массовую долю белка, плотность, СОМО и массовую долю жира в молоке и сливках.